Τεχνολογία μεμβράνης και διαύγαση εμβολίου (Ⅰ)
Τα εμβόλια προέρχονται από ποικίλες πηγές, συμπεριλαμβανομένων εκχυλισμάτων ιστών, βακτηριακών κυττάρων, ιικών σωματιδίων, πρωτεϊνών και νουκλεϊκών οξέων που παράγονται από ανασυνδυασμένα κύτταρα θηλαστικών, κύτταρα ζυμομύκητα και εντόμων.
Η πιο κοινή μέθοδος παραγωγής εμβολίου βασίζεται σε μια αρχική διαδικασία ζύμωσης που ακολουθείται από καθαρισμό. Η παραγωγή εμβολίων είναι μια πολύπλοκη διαδικασία που περιλαμβάνει πολλά διαφορετικά στάδια και διαδικασίες. Η επιλογή της σωστής μεθόδου καθαρισμού είναι κρίσιμη για την επίτευξη της επιθυμητής καθαρότητας του τελικού προϊόντος. Η διαύγαση των εμβολίων είναι ένα σημαντικό βήμα που έχει σημαντικό αντίκτυπο στην ανάκτηση του προϊόντος και τον επακόλουθο καθαρισμό κατάντη. Μπορούν να χρησιμοποιηθούν διάφορες τεχνικές για την αποσαφήνιση των εμβολίων. Η επιλογή της μεθόδου συλλογής και του εξοπλισμού εξαρτάται από τον τύπο της μπαταρίας, τη φύση του προϊόντος που συλλέγεται και το υγρό διεργασίας. Αυτές οι τεχνικές περιλαμβάνουν φιλτράρισμα μεμβράνης (μικροδιήθηση, διήθηση εφαπτομενικής ροής), φυγοκέντρηση και βαθιά διήθηση (φιλτράρισμα κανονικής ροής). Από μακρόχρονη εμπειρία, η διαύγαση της συλλογής του εμβολίου συνήθως επιτυγχάνεται με φυγοκέντρηση που ακολουθείται από βαθιά διήθηση.
Τα τελευταία χρόνια, οι τεχνικές που βασίζονται σε μεμβράνες έχουν αποκτήσει εξέχουσα θέση στη διαύγαση των εμβολίων. Οι διαδικασίες ανάντη χρησιμοποιούν ολοένα και περισσότερο τεχνολογίες μιας χρήσης, επομένως οι στρατηγικές συγκομιδής πρέπει να αλλάξουν. Αυτό το άρθρο παρέχει μια ολοκληρωμένη επισκόπηση των διαφορετικών τεχνολογιών που βασίζονται στη μεμβράνη και των εφαρμογών τους στη διαύγαση εμβολίων.
01 Εισαγωγή
Τα εμβόλια αποτελούν κρίσιμο συστατικό της πρόληψης των μολυσματικών ασθενειών, οι οποίες παραμένουν μια συγκλονιστική αιτία θανάτου. Μεταξύ 2 και 3 εκατομμυρίων ανθρώπων σώζονται από τη διφθερίτιδα, τον τέτανο, τον κοκκύτη και την ιλαρά κάθε χρόνο χάρη στον εμβολιασμό. Τα εμβόλια καλύπτουν ένα ευρύ φάσμα, από μικρές ανασυνδυασμένες πρωτεΐνες έως ολόκληρα σωματίδια ιού και ολόκληρα βακτήρια. Μπορούν να παραχθούν από διαφορετικά συστήματα: αυγά, κύτταρα θηλαστικών, βακτήρια, κ.λπ. Λόγω της πολυπλοκότητας και της ποικιλομορφίας των εμβολίων, δεν υπάρχει επί του παρόντος πρωτόκολλο ή πρότυπο γενικού καθαρισμού, παρά το αυξανόμενο ενδιαφέρον για πλατφόρμες εμβολίων.
Τυπικά, μια διαδικασία εμβολίου μπορεί να χωριστεί σε τρία μέρη: ανάντη (παραγωγή και διαύγαση), κατάντη επεξεργασία (καθαρισμός συμπεριλαμβανομένης της υπερδιήθησης, χρωματογραφίας και χημικής επεξεργασίας) και σύνθεση (λειτουργίες τελικής πλήρωσης). Ανεξάρτητα από το σύστημα παραγωγής, η διαύγαση (η αρχική αφαίρεση ανεπιθύμητων ουσιών) διαδραματίζει βασικό ρόλο στον καθορισμό μιας ισχυρής διαδικασίας καθαρισμού. Ένα σωστό βήμα διαύγασης αφαιρεί κυρίως ολόκληρα κύτταρα, κυτταρικά υπολείμματα, κολλοειδή και μεγάλα συσσωματώματα για να μειώσει το βάρος της κατάντη επεξεργασίας. Σε ορισμένες περιπτώσεις, η διαύγαση μπορεί επίσης να μειώσει τις αδιάλυτες ακαθαρσίες, τις πρωτεΐνες του κυττάρου ξενιστή (HCP) και τα νουκλεϊκά οξέα του κυττάρου ξενιστή. Όπως κάθε άλλο στάδιο καθαρισμού, το στάδιο διαύγασης πρέπει να βελτιστοποιηθεί για να επιτευχθεί η μέγιστη απόδοση και καθαρότητα προϊόντος, ενώ προσαρμόζεται στην ειδικότητα και τους περιορισμούς παραγωγής του εμβολίου.
Λόγω της ετερογένειας των τύπων εμβολίων, χρησιμοποιούνται διάφορες τεχνικές για τη διαύγαση, συμπεριλαμβανομένης της φυγοκέντρησης ή της διήθησης (Πίνακας 1).
Συνήθως απαιτούνται αρκετές σειρές λειτουργιών για να επιτευχθεί η επιθυμητή διευκρίνιση. Η πρώτη λειτουργία έχει σχεδιαστεί για την αφαίρεση μεγαλύτερων σωματιδίων (πρωτογενής διαύγαση) και η δεύτερη λειτουργία έχει σχεδιαστεί για την αφαίρεση κολλοειδών και άλλων σωματιδίων μικρότερου μεγέθους (δευτερεύουσα διαύγαση). Η φυγοκέντρηση χαμηλής ταχύτητας χρησιμεύει ως επιλογή διαύγασης εφάπαξ, επιτρέποντας την απομάκρυνση των κυττάρων και των κυτταρικών υπολειμμάτων με καθίζηση. Η φυγοκέντρηση μπορεί να χειριστεί υψηλά στερεά φορτία και έχει χρησιμοποιηθεί ευρέως σε φυγόκεντρες κατά παρτίδα ή συνεχή λειτουργία και δίσκους. Απαιτεί υψηλές επενδύσεις κεφαλαίου και κόστος συντήρησης και αντιμετωπίζει προκλήσεις στην κλιμάκωση λόγω της έλλειψης αξιόπιστου μοντέλου μείωσης της κλίμακας. Ωστόσο, ορισμένοι εμπορικοί κατασκευαστές εμβολίων χρησιμοποιούν φυγοκεντρητές σε μεγάλης κλίμακας παραγωγή που περιλαμβάνει μεγάλους όγκους επεξεργασίας και περισσότερες παραγωγικές δραστηριότητες.
Η διήθηση διαύγασης μπορεί να πραγματοποιηθεί με διήθηση κανονικής ροής (NFF, επίσης γνωστή ως διήθηση αδιέξοδου) ή διήθηση εφαπτομενικής ροής (TFF, επίσης γνωστή ως διήθηση εγκάρσιας ροής). Υπάρχουν επίσης συγκεκριμένες λειτουργίες φίλτρου (βαθιά φίλτρα) που περιέχουν θετικά φορτισμένα υλικά και φίλτρο AIDS που ενισχύουν τη συγκράτηση των κυτταρικών υπολειμμάτων, των κολλοειδών και των αρνητικά φορτισμένων ανεπιθύμητων συστατικών.
Τα φίλτρα μεμβράνης συγκρατούν τα σωματίδια με εξαίρεση το μέγεθος και δεν έχουν υψηλή ικανότητα συγκράτησης ρύπων, επομένως είναι κατάλληλα για δευτερεύοντα στάδια διαύγασης. Τόσο τα βαθιά φίλτρα όσο και τα φίλτρα μεμβράνης είναι εύκολο να κλιμακωθούν και να εφαρμοστούν (απλή σχεδίαση συστήματος). Σε αντίθεση με το NFF, το TFF χρησιμοποιείται κυρίως για πρωτογενή διαύγαση (μικροδιήθηση). Μεμβράνες με εύρος αποκοπής 0.1-0.65 μm (κατά προτίμηση με ανοιχτό κανάλι) έχουν χρησιμοποιηθεί με επιτυχία για τη συγκράτηση κυττάρων, κυτταρικών υπολειμμάτων και άλλων μεγάλων ρύπων. Ο περισσότερος εξοπλισμός TFF είναι γραμμικά επεκτάσιμος και επαναχρησιμοποιήσιμος μετά τον καθαρισμό, γεγονός που μειώνει σημαντικά το κόστος των αναλώσιμων για το βήμα.
Το βήμα διευκρίνισης βρίσκεται μεταξύ των διεργασιών ανάντη και κατάντη και μερικές φορές παραβλέπεται κατά την ανάπτυξη της διεργασίας του εμβολίου, επειδή ο χρόνος και οι πόροι έχουν προτεραιότητα για άλλα στάδια καθαρισμού, όπως η χρωματογραφία ή η φυγοκέντρηση βαθμίδωσης πυκνότητας.
Ακόμη και τα διπλώματα ευρεσιτεχνίας για τις διαδικασίες παρασκευής εμβολίων συχνά παραλείπουν το βήμα διευκρίνισης. Η αποτελεσματικότητα της αποσαφήνισης επηρεάζει άμεσα την απόδοση της κατάντη διαδικασίας. Ένα ανεπαρκώς βελτιστοποιημένο βήμα διαύγασης μπορεί να επηρεάσει αρνητικά τη χωρητικότητα του αποστειρωμένου φίλτρου ή μπορεί να μειώσει τη διάρκεια ζωής της χρωματογραφικής ρητίνης. Σήμερα, οι αυστηρότερες ρυθμιστικές προσδοκίες τείνουν να κάνουν τους κατασκευαστές εμβολίων να παράγουν πιο καθαρά, καλά χαρακτηρισμένα αλλά οικονομικά εμβόλια. Σε αυτή την περίπτωση, σε κάθε βήμα πρέπει να δοθεί η προσοχή που του αξίζει. Οι τρέχουσες τάσεις υποδηλώνουν ότι η ανάντη διαδικασία κινείται προς ένα «καθαρότερο» σύστημα έκφρασης (δηλαδή τα κύτταρα που καλλιεργούνται σε μέσα χωρίς ορό αντικαθιστούν τα ωάρια) με αυξημένη παραγωγικότητα και υψηλότερη κυτταρική πυκνότητα.
Οι μεταγενέστερες διαδικασίες καθαρισμού απλοποιούνται και απλοποιούνται για να αυξηθεί η καθαρότητα του τελικού προϊόντος. Για να χειριστείτε αυτές τις αλλαγές, το βήμα διευκρίνισης δεν μπορεί να γίνει εμπόδιο. Σε αυτήν την περίπτωση, η τεχνολογία φιλτραρίσματος ανταποκρίνεται σε μια νέα πρόκληση διευκρίνισης, αντιμετωπίζοντας τα ζητήματα της αυξημένης ευελιξίας της διαδικασίας, της δυνατότητας μιας χρήσης και του μειωμένου επενδυτικού κόστους.
02 Διευκρίνιση των εμβολίων κατά του ιού
Διάφοροι τύποι μεθόδων διαύγασης, είτε μόνες τους είτε σε συνδυασμό, έχουν χρησιμοποιηθεί επιτυχώς για την αποσαφήνιση της συγκομιδής στο τέλος της τροφοδοσίας των εμβολίων.
Πιλοτική κλίμακα :1-20L, κλίμακα παραγωγής: μεγαλύτερη από 20 λίτρα
2.1 Προφυλάξεις για την αποσαφήνιση του εμβολίου κατά του ιού
Πολλά εμβόλια περιέχουν όλα ή μέρος των σωματιδίων του ιού για να σχηματίσουν ανοσία έναντι της ιογενούς λοίμωξης. Γενικά εμπίπτουν σε τέσσερις μεγάλες κατηγορίες:
Ζωντανό εξασθενημένο εμβόλιο (LAV), το οποίο βασίζεται σε ένα εξασθενημένο στέλεχος του ιού για τη μείωση της μολυσματικότητάς του. Οι εξασθενημένοι ιοί μπορούν να πολλαπλασιαστούν στο σώμα αλλά δεν είναι παθογόνοι.
- Εμβόλια αδρανοποιημένου ιού (IV), τα οποία περιέχουν χημικά ή υπεριώδες αδρανοποιημένους ιούς για την εξάλειψη της μολυσματικότητας. Τα σωματίδια του ιού μπορούν να είναι πλήρη, διαιρεμένα ή καθαρισμένα (μόνο αντιγονικές πρωτεΐνες).
- Το εμβόλιο ιικού φορέα (VV) είναι ένας ενεργός, μη παθογόνος ιός που παρουσιάζει το αντιγόνο ενός παθογόνου ιού. Αυτές οι δομές που αναπτύχθηκαν πρόσφατα χρησιμοποιούνται επίσης για εφαρμογές γονιδιακής θεραπείας.
Εμβόλια σωματιδίων τύπου ιού (VLPs), μια συγκεκριμένη κατηγορία εμβολίων ιικής υπομονάδας που μιμούνται τη συνολική δομή των ιικών σωματιδίων αλλά δεν περιέχουν μολυσματικό γενετικό υλικό.
Στις περισσότερες περιπτώσεις, τα ιικά σωματίδια είναι εντελώς άθικτα κατά το στάδιο της διαύγασης, ακόμη και κατά τη λύση του ιικού εμβολίου (η διάσπαση πραγματοποιείται συνήθως κατάντη, σε πιο καθαρό περιβάλλον).
Η κύρια πρόκληση της διαύγασης του ιού είναι η ανάκτηση ιικών σωματιδίων υψηλής απόδοσης, ενώ απομακρύνονται αποτελεσματικά τα κυτταρικά υπολείμματα, τα μεγάλα συσσωματώματα και οι αδιάλυτες προσμείξεις. Όπως περιγράφεται στις επόμενες ενότητες, υπάρχουν αρκετοί παράγοντες που μπορούν να προκαλέσουν υποβάθμιση ή απώλεια του ιού. Επιπλέον, μπορεί να είναι δύσκολο να βασιστεί κανείς στην απόδοση του ιού λόγω της υψηλής μεταβλητότητας των μεθόδων ποσοτικής ανάλυσης του ιού σε αυτό το στάδιο της διαδικασίας, ειδικά για τα εμβόλια LAV και VV. Για αυτά τα εμβόλια, η απόδοση του ιού συχνά αξιολογείται χρησιμοποιώντας τεστ μολυσματικότητας όπως το τεστ πλάκας ή το τεστ TCID 50. Το γεγονός ότι ορισμένες από τις συλλεγόμενες ενώσεις μπορεί να παρεμβαίνουν στην ικανότητα του ιού να μολύνει τα ενδεικτικά κύτταρα αυξάνει τη μεταβλητότητα αυτής της ποσοτικής προσέγγισης.
2.2 Στρατηγική αποσαφήνισης του εμβολίου κατά του ιού
Τα ιικά εμβόλια ποικίλλουν πολύ σε μέγεθος, δομή, σχήμα και συστήματα έκφρασης (Πίνακας 3).
Ως αποτέλεσμα, δεν υπάρχει γενικά πρότυπο για τις κατάντη διεργασίες του, ειδικά τα βήματα διευκρίνισης. Θεωρητικά, όλες οι διαθέσιμες τεχνικές (φυγοκέντρηση χαμηλής ταχύτητας, μικροδιήθηση TFF, NFF) μπορούν να επιλεγούν και ενδεχομένως να συνδυαστούν για την αποσαφήνιση του ιού. Στην πραγματικότητα, η επιτυχία των μεθόδων αποσαφήνισης επηρεάζεται από το σύστημα έκφρασης και τις φυσικοχημικές ιδιότητες των εμπλεκόμενων ιών.
Recently, the high cell density process of viral vaccines is being explored. High cell density processes add to the challenge of clarification. Many treatment methods are by preconditioning, i.e. polymer-induced flocculation, precipitation, alternating TFF, etc. For example, Tomic et al. describe a method for high cell density collection (>Η μέθοδος διαύγασης {{0}} κυττάρων /ml), χρησιμοποιώντας κατιονικά πολυμερή, μείωσε την περιοχή βαθιάς διήθησης κατά 4 φορές σε σύγκριση με τις παραδοσιακές μεθόδους. Αυτή η τεχνική επιτρέπει τη συλλογή ζυμωτηρίων μεγάλης χωρητικότητας χωρίς τη χρήση φυγοκεντρητών. Ομοίως, οι Riske et al. έδειξε ότι η επεξεργασία με χιτοζάνη κυτταροκαλλιεργειών 40 L (0,02%) που περιείχαν 1,{6}},6% στερεά οδήγησε σε 7-πλάσια αύξηση στην απόλυτη χωρητικότητα του φίλτρου μετά από βαθιά διήθηση.
Αναφέρουν επίσης ότι η χιτοζάνη φαίνεται να βελτιώνει την αποτελεσματικότητα της διαύγασης κροκιδώνοντας σωματίδια υπομικρών, τα οποία συνήθως καθιζάνουν σε φυγοκεντρητές. Οι μέθοδοι προεπεξεργασίας και κροκίδωσης είναι πιθανό να συνεχίσουν να αποτελούν μέρος των μελλοντικών διευκρινίσεων για τη διήθηση του εμβολίου. Τα διεισδυτικά, συμπεριλαμβανομένων των σακχάρων, των γλυκόλων και των αμινοξέων, κροκιδώνουν κατά προτίμηση τους ιούς. Η κροκίδωση του ιού με οσμωτικό διάλυμα ακολουθούμενη από 0.2μ μικροδιήθηση μπορεί να χρησιμοποιηθεί ως μια ολοκληρωμένη διαδικασία για τον καθαρισμό του ιού. Τα διεισδυτικά μπορούν να διεγείρουν τη συσσωμάτωση του ιού μειώνοντας το στρώμα ενυδάτωσης γύρω από τα σωματίδια για να κροκιδώσουν τα υδρόφοβα μη-ενθυλακωμένα σωματίδια του ιού και τα ενθυλακωμένα σωματίδια του ιού. Αν και έχει αποδειχθεί ότι τα διεισδυτικά κροκιδώνουν τους ιούς, η μέθοδος έχει τη δυνατότητα να αποτελέσει πλατφόρμα για μελλοντικό καθαρισμό εμβολίων και η σκοπιμότητά της σε πιλοτικό ή μεγάλης κλίμακας καθαρισμό εμβολίου δεν έχει αποδειχθεί. Η μέθοδος προεπεξεργασίας κροκίδωσης, η οποία είναι πιθανό να συνεχίσει να αποτελεί μέρος της μελλοντικής διαύγασης του φίλτρου εμβολίου, εκτελείται σε ζυμωτήρα 2L. Προκειμένου να χρησιμοποιηθούν δυνητικά σε παραγωγικές εργασίες μεγάλης κλίμακας, αυτές οι μέθοδοι πρέπει να επικυρωθούν σε πιλοτικές και παραγωγικές κλίμακες.
2.2.1 Έκφραση του αντίκτυπου του συστήματος
Η μέθοδος αποσαφήνισης εξαρτάται κυρίως από τον τύπο της διαδικασίας και του συστήματος έκφρασης ανάντη, το οποίο καθορίζει τον τύπο και το επίπεδο των ρύπων που πρέπει να αφαιρεθούν. Τα ιικά εμβόλια παράγονται συνήθως σε έμβρυα κοτόπουλου από συνεχείς κυτταρικές σειρές θηλαστικών ή πτηνών ή κύτταρα βακουλοϊού/εντόμων, τα οποία είναι ένα πιο περίπλοκο σύστημα έκφρασης. Ορισμένοι τύποι VLP μπορούν επίσης να παραχθούν από άλλα ετερόλογα συστήματα έκφρασης (βακτήρια, ζυμομύκητες, φυτικά κύτταρα).
2.2.1.1 Ιός που παράγεται σε έμβρυο κοτόπουλου
Τα εμβόλια παράγονται στα αυγά εδώ και δεκαετίες. Αυτή η εργασία χρονολογείται από το 1931, όταν ο Woodruff και ο Good Pasture χρησιμοποίησαν με επιτυχία τη χοριοαλλαντοϊκή μεμβράνη των γόνιμων αυγών ως υπόστρωμα για την ανάπτυξη του ιού. Σήμερα, πολλά ανθρώπινα και κτηνιατρικά εμβόλια εξακολουθούν να παράγονται χρησιμοποιώντας αυτή την αρχαία διαδικασία. Το πιο γνωστό είναι ίσως το εμβόλιο της εποχικής γρίπης. Η αρχή είναι να εμβολιάζονται τα αυγά κοτόπουλου με ιούς που μας ενδιαφέρουν και στη συνέχεια να αναπαράγονται στη χοριοαλλαντοϊκή μεμβράνη. Μετά την αναπαραγωγή, συλλέγεται και καθαρίζεται αλλαντοϊκό υγρό πλούσιο σε ιικά σωματίδια.
Το αλλαντοϊκό υγρό είναι μια προκλητική διαυγαστική τροφή. Η υψηλή περιεκτικότητά του σε μέταλλα και πρωτεΐνες (συμπεριλαμβανομένης της ωολευκωματίνης) του προσδίδει υψηλό ιξώδες. Το αλλαντοϊκό υγρό περιέχει επίσης βασικές ενώσεις ιστών από έμβρυα κοτόπουλου, όπως φτερά, ράμφη, αιμοφόρα αγγεία ή αιμοσφαίρια. Λόγω της υψηλής περιεκτικότητας σε στερεά, η φυγοκέντρηση χαμηλής ταχύτητας είναι η προτιμώμενη επιλογή για την πρωτογενή διαύγαση, η οποία συνήθως οδηγεί σε ποσοστό ανάκτησης περίπου 70%. Ωστόσο, είναι επίσης δυνατή η πρωτογενής διαύγαση με τη χρήση τεχνικών φιλτραρίσματος. Για το NFF, τα βαθιά φίλτρα με βάση το πολυπροπυλένιο και την κυτταρίνη έχουν καλές δυνατότητες συλλογής αλλαντοϊκού υγρού. Τα επιφανειακά φίλτρα που κατασκευάζονται από βαθιά φίλτρα πολυπροπυλενίου ή κυτταρίνης μπορούν να έχουν χωρητικότητα 150-210 L/m² και να μειώσουν τη θολότητα της ροής τροφοδοσίας έως και 3 φορές. Η συσκευή ανοιχτού καναλιού τροφοδοσίας TFF είναι επίσης κατάλληλη για διαύγαση αλλαντοϊκού υγρού, καθώς η συσκευή είναι πιο κατάλληλη για ελάχιστη απώλεια πίεσης μέσω του καναλιού τροφοδοσίας, μειώνοντας έτσι την απόφραξη του καναλιού.
Το δευτερεύον βήμα διευκρίνισης μπορεί να γίνει εύκολα με το NFF. Ένας συνδυασμός υλικών από πολυπροπυλένιο, κυτταρίνη και ίνες γυαλιού δείχνει γενικά καλή απόδοση και μια εναλλακτική λύση στο δευτερεύον βήμα διαύγασης είναι η χρήση TFF και συσκευής μεμβράνης μικροδιήθησης {{0}.65μm ή 0,45μm και η λειτουργία οσμωτικής ροής έλεγχος. Σε αυτό το βήμα μπορεί να χρησιμοποιηθεί μια συσκευή TFF ανοιχτού καναλιού με υδρόφιλο PVDF ή υδρόφιλη μεμβράνη PES.
Είναι σημαντικό να σημειωθεί ότι τα ιικά σωματίδια μπορεί να συσχετίζονται με αδιάλυτο υπολειμματικό υλικό, το οποίο μπορεί να μειώσει σημαντικά την παραγωγή του ιού κατά τη διαύγαση. Η χρήση ενός διαλύματος άλατος μπορεί να μειώσει αυτή τη συσχέτιση μεταξύ των ιών της γρίπης και των στερεών θραυσμάτων, με αποτέλεσμα μια περίπου διπλάσια αύξηση της παραγωγής χωρίς να επηρεάζεται η ακεραιότητα των ιικών σωματιδίων.
2.2.1.2 Ιοί που παράγονται σε διαδοχικές κυτταρικές σειρές θηλαστικών και πτηνών
Πρόσφατα, ορισμένα εμβόλια για ιούς έχουν απομακρυνθεί από τις διεργασίες που βασίζονται στα αυγά προς όφελος των διεργασιών που βασίζονται σε κυτταροκαλλιέργεια (ειδικά για τα εμβόλια της γρίπης). Ο κύριος λόγος αυτής της αλλαγής είναι η πρόληψη προβλημάτων παραγωγής εμβολίων που σχετίζονται με τα εμβρυϊκά αυγά (δηλαδή έλλειψη προμήθειας αυγών που μπορεί να προκύψει σε περίπτωση εμφάνισης οποιασδήποτε επιδημίας ασθένειας των πουλερικών). Ως αποτέλεσμα, πολλοί τύποι εμβολίων και ιικοί φορείς αναπτύσσονται επί του παρόντος χρησιμοποιώντας συνεχείς κυτταρικές σειρές από θηλαστικά ή πτηνά, συμβατικές κυτταρικές σειρές (όπως κυτταρικές σειρές Vero, MDCK ή HEK293) ή ιδιόκτητες κυτταρικές σειρές.
Ανάλογα με το σύστημα έκφρασης, ο ιός μπορεί να παραμείνει μέσα στο κύτταρο, απαιτώντας ένα στάδιο κυτταρικής λύσης ή μπορεί να παραμείνει έξω από το κύτταρο (λύση ή εκβλάστηση). Το στερεό φορτίο και το διαλυτό περιεχόμενο που λαμβάνεται από την κυτταρική καλλιέργεια είναι πολύ πιο καθαρά από την αλλαντοϊκή υγρή φάση. Ως αποτέλεσμα, η τεχνολογία NFF είναι ευκολότερη στην εφαρμογή και η χωρητικότητα είναι σημαντικά υψηλότερη. Ωστόσο, η ικανότητα διήθησης εξαρτάται σε μεγάλο βαθμό από τις συνθήκες κυτταροκαλλιέργειας, όπως η κυτταρική πυκνότητα ή η βιωσιμότητα των κυττάρων κατά τη συγκομιδή. Αυτές οι παράμετροι επηρεάζουν την ποσότητα των κυτταρικών υπολειμμάτων και των μακροσυσσωματωμάτων που μπορούν να φράξουν βαθιά φίλτρα και μεμβράνες, με αποτέλεσμα τη μειωμένη χωρητικότητα.
Οι Thomassen et al παρέχουν ένα καλό παράδειγμα διευκρίνισης του NFF. Χρησιμοποιείται στη διαδικασία παραγωγής αδρανοποιημένου ιού πολιομυελίτιδας (IPV). Κύτταρα Vero που καλλιεργήθηκαν σε μικροφορείς χρησιμοποιήθηκαν για ιικό πολλαπλασιασμό με κυτταρική πυκνότητα {{0}},78 x 106 κύτταρα /ml TOI. Χρησιμοποιείται σήτα από ανοξείδωτο χάλυβα 75μm για προδιαύγεια για την αφαίρεση μικροφορέων από τη συγκομιδή. Η διαβάθμιση διπλής στρώσης διευκρινίζεται χρησιμοποιώντας ένα βαθύ φίλτρο πυκνότητας (0.{7}}.0μm), ακολουθούμενο από ένα αποστειρωμένο φίλτρο ποιότητας.
Η επιλεγμένη κλιμακούμενη αναλώσιμη μονάδα χρησιμοποιήθηκε με επιτυχία για την παρασκευή υλικού κλινικής δοκιμής Sabin IPV σε κλίμακα 350 L. Ανάλογα με τον ορότυπο του ιού, επιτυγχάνεται ποσοστό ανάκτησης ιού από 86 έως 96 τοις εκατό.
2.2.1.3 Σωματίδια βακουλοϊού/όμοια με ιούς που παράγονται στο κυτταρικό σύστημα εντόμων
Η εξέταση των συστημάτων βακουλοϊών/κυττάρων εντόμων για παραγωγή εμβολίων μεγάλης κλίμακας είναι σχετικά νέα, αλλά προσελκύει αυξανόμενο ενδιαφέρον στον τομέα των ιικών φορέων και των VLPs. Το κύριο πλεονέκτημα αυτού του συστήματος είναι ότι περιλαμβάνει βραχύβια (χωρίς ανάγκη δημιουργίας κυτταρικών σειρών) και ασφαλή (χωρίς πλήρες ιικό DNA) παραγωγή. Υπάρχουν επίσης ορισμένα μειονεκτήματα, όπως η ανάγκη αφαίρεσης του βακουλοϊού και η σταθερότητα του προϊόντος.
Το Cervarix, ένα εμβόλιο VLP κατά της μόλυνσης από τον ιό των ανθρώπινων θηλωμάτων που παράγεται από την GlaxoSmithKline, είναι το πρώτο ανθρώπινο εμβόλιο που παράγεται στο εμπόριο σε κύτταρα εντόμων. Ένας αριθμός εμβολίων που βασίζονται σε VLPs και φορείς rAAV που παράγονται σε κύτταρα εντόμων που έχουν μολυνθεί από βακουλοϊό βρίσκεται επί του παρόντος υπό ανάπτυξη. Οι κυτταρικές σειρές εντόμων που προέρχονται από τον φθινοπωρινό στρατό σκώληκα Spodoptera frugiperda (Sf9 και Sf21) και τον σκώληκα του λάχανου Trichoplusia ni (BTI-TN5B1-4 κύτταρα) είναι τα πιο κοινά χρησιμοποιούμενα λόγω της ικανότητάς τους να αναπτύσσονται σε εναιώρημα, γεγονός που απλοποιεί την ενίσχυση του ανάντη διαδικασία. Αφού αναπτυχθούν στην επιθυμητή πυκνότητα ζωντανών κυττάρων, αυτά τα κύτταρα μολύνονται με ανασυνδυασμένο βακουλοϊό στην εκθετική φάση κυτταρικής ανάπτυξης για έκφραση πρωτεΐνης. Το μεγάλο γονιδίωμα των βακουλοϊών επιτρέπει την έκφραση πέντε ή περισσότερων διαφορετικών πρωτεϊνών, που ταιριάζει με την πολυπλοκότητα του VLP και των ιικών φορέων.
Οι Bernard et al. περιέγραψε την κατάντη διαδικασία καλλιέργειας κυττάρων εντόμων. Η διαδικασία είναι εξαιρετικά μεταβλητή, αντανακλώντας την ποικιλία των πρωτεϊνών που παράγονται με αυτήν την τεχνική. Το πρώτο βήμα της αλληλουχίας καθαρισμού επηρεάζεται σε μεγάλο βαθμό από τα χαρακτηριστικά όγκου του βιοαντιδραστήρα (δηλ. πυκνότητα και βιωσιμότητα κυττάρου) ή από τη φύση της απελευθέρωσης του προϊόντος (που εκκρίνεται με εκβλάστηση ή κυτταρική λύση). Η μόλυνση από βακουλοϊό κυττάρων εντόμων μπορεί να προκαλέσει λύση κυττάρων εντός 3-5 ημερών. Η καταστροφή των κυττάρων μπορεί να οδηγήσει σε αύξηση της πρωτεολυτικής δραστηριότητας και άλλων περιβαλλοντικών παραγόντων που μπορεί να οδηγήσουν στην αποικοδόμηση των ανασυνδυασμένων πρωτεϊνών.
Έχουν γίνει προσπάθειες να αναπτυχθούν βακουλοϊοί με χαμηλότερη ικανότητα έναρξης κυτταρικής λύσης. Ο βακουλοϊός λύει λιγότερο από το 10 τοις εκατό των μολυσμένων εντόμων.
Η λύση των κυττάρων μπορεί να πραγματοποιηθεί χρησιμοποιώντας διαφορετικές μεθόδους, όπως κατάψυξη-απόψυξη, απορρυπαντικά, ομογενοποιητές ή επεξεργασία με υπερήχους. Τα κύτταρα των εντόμων δεν έχουν κυτταρικό τοίχωμα και επομένως διαλύονται γρήγορα. Αν και η θεραπεία με υπερήχους έχει αναφερθεί σε πολλές διεργασίες πάγκου, σπάνια χρησιμοποιείται σε πειραματική ή εμπορική κλίμακα. Η πιο κοινή μέθοδος είναι η χρήση ομογενοποιητή για την καταστροφή κυττάρων παρουσία απορρυπαντικού χαμηλής συγκέντρωσης (0,1% Triton X-100 ή NP-40). Η χρήση απορρυπαντικών και η μικρορευστοποίηση ή η ομογενοποίηση με οσμωτική κρούση έχουν χρησιμοποιηθεί με επιτυχία σε πολλές διαδικασίες παραγωγής μεγάλης κλίμακας. Τυπικά, τα κύτταρα εντόμων αιωρούνται σε ρυθμιστικά διαλύματα λύσης (50 mM TRIS pH7,7, 300 mM NaCl, 5% γλυκερόλη, 0,2 mM PMSF και αναστολείς πρωτεάσης), κατά τη διάρκεια των οποίων Triton-X100 προστίθεται σε τελική συγκέντρωση 0,1%, ακολουθούμενο από ήπιο υπερηχογράφημα ή μικρορευστοποίηση. Το μίγμα στη συνέχεια φυγοκεντρείται για να απομακρυνθούν τα αδιάλυτα σωματίδια.
Σε αυτό το στάδιο, το προϊόν λύσης μπορεί να φαίνεται πολύ θολό και είναι δύσκολο να φιλτραριστεί χρησιμοποιώντας ένα φίλτρο 0,45μm. Μερικές φορές μπορεί να παρατηρηθούν απώλειες έως και 30% κατά τη διάρκεια του βήματος διαύγασης της πυρόλυσης. Η προσθήκη βενζοενζύμων στο στάδιο της διάσπασης βοηθά στην επίλυση του προβλήματος της διήθησης. Ο καθαρισμός των κυττάρων με άλμη ρυθμισμένο με φωσφορικά μετά τη συγκομιδή και την ταχεία "κατάψυξη-απόψυξη" σε υψηλό αλάτι (500 mM NaCl) που περιέχει το ρυθμιστικό διάλυμα πυρόλυσης βοηθά στην απομάκρυνση των συσσωματωμάτων.
Η διαύγαση των VLP και των ιικών φορέων που παράγονται από κύτταρα εντόμων λαμβάνει χώρα μετά την κυτταρική λύση (με χημική ή μηχανική επεξεργασία), η οποία απελευθερώνει όχι μόνο ιικά σωματίδια αλλά και μεγάλες ποσότητες κυτταρικού νουκλεϊκού οξέος. Τα κύτταρα των εντόμων μπορούν να αναπτυχθούν με υψηλή κυτταρική πυκνότητα, από 1-9.10 6 κύτταρα/ml. Επομένως, το βήμα διαύγασης θα πρέπει να αφορά την υψηλή κυτταρική πυκνότητα, την υψηλή περιεκτικότητα σε νουκλεϊκό οξύ και, εάν είναι δυνατόν, την απομάκρυνση των σωματιδίων του βακουλοϊού. Για να γίνουν τα πράγματα πιο περίπλοκα, οι VLP ή οι ιικοί φορείς και οι βακουλοϊοί μπορεί να έχουν παρόμοια μεγέθη (οι βακουλοϊοί έχουν πλάτος 60-80 νανόμετρα και μήκος 300-400 νανόμετρα). Λόγω της υψηλής πυκνότητας των κυττάρων, η φυγοκέντρηση είναι η προτιμώμενη τεχνική για την πρωτογενή διαύγαση για δεκαετίες. Ωστόσο, οι διεργασίες μεμβράνης φαίνεται να είναι μια πολύ ελκυστική εναλλακτική λύση επειδή η επεκτασιμότητα είναι εύκολο να καθοριστεί.
Τα βαθιά φίλτρα έχουν χρησιμοποιηθεί αποτελεσματικά στην κατάντη διαδικασία σωματιδίων που μοιάζουν με ροταϊούς τριών στρωμάτων. Σε εργαστηριακό επίπεδο, η μέθοδος υπερφυγοκέντρησης βαθμίδωσης πυκνότητας CsCl χρησιμοποιείται συχνά για τον καθαρισμό αυτών των πολύπλοκων σωματιδίων. Οι ερευνητές αξιολόγησαν όχι μόνο το βήμα διαύγασης του βαθέως φίλτρου, αλλά και ολόκληρη τη διαδικασία κατάντη (διάσπαση και βαθιά διήθηση Triton X-100, ακολουθούμενη από υπερδιήθηση και αποκλεισμό μεγέθους σωματιδίων). Τα αποτελέσματα δείχνουν ότι η απόδοση της βαθμίδας πυκνότητας CsCl μπορεί να φτάσει το 37%.
Η υπερφυγόκεντρη μέθοδος είναι περίπου 10%. Ως άλλο παράδειγμα, κοίλες ίνες 0,45 μm και ίνες λεπτής διαμέτρου 500 kDa χρησιμοποιήθηκαν για την ανάκτηση και τη συγκέντρωση σωματιδίων που μοιάζουν με τον HIV που παράγονται σε κύτταρα εντόμων. Σε αυτή τη μελέτη, η δύναμη διάτμησης των κοίλων ινών βελτιστοποιήθηκε με βάση την ακεραιότητα των κυττάρων. Αποτελέσματα Καθιερώθηκε μια διαδικασία χαμηλής διατμητικής δύναμης για να αντικαταστήσει την υπερφυγοκέντρηση με κλίση επιτραπέζιας ζάχαρης.
Η διαδικασία έχει τη δυνατότητα να εφαρμοστεί στη μαζική παραγωγή. Τα βαθιά φίλτρα έχουν επίσης χρησιμοποιηθεί με επιτυχία στην παραγωγή ανασυνδυασμένων αδενο-σχετιζόμενων ιών. Η κυτταρική λύση πραγματοποιήθηκε με μηχανικό παρεμβολέα κυψελών δύο εμβόλων, ακολουθούμενη από επεξεργασία με νουκλεάση. Στο βήμα της διαύγασης χρησιμοποιήθηκε στοιχείο φίλτρου βάθους ινών γυαλιού 1,2μm, ακολουθούμενο από δύο στρώματα υδρόφιλου PES 0,8μm και υδρόφιλου PES 0,2μm. Τα φίλτρα αναλογικού μεγέθους χρησιμοποιούνται για παρτίδες διεργασιών από μικρότερα έως μεγέθη 200 L. Τα βαθιά φίλτρα έχουν χρησιμοποιηθεί με επιτυχία και οι αξιολογήσεις TFF με επίπεδες μεμβράνες ή κοίλες ίνες 0,2 μm ή 0,45 μm έχουν επίσης αναφερθεί ότι είναι πολύ αποτελεσματικές.
Η μελέτη της Tecnologica (IBET) στο Ινστιτούτο Πειραματικής Βιολογίας Oeiras στην Πορτογαλία χρησιμοποίησε το NFF για τη διευκρίνιση του VLP της ηπατίτιδας C που εκφράζεται από βακουλοϊούς χωρίς φυγοκέντρηση. Τα ονομαστικά φίλτρα πολυπροπυλενίου (10,5,0.6 και 0.3μm) χρησιμοποιούνται για την αποσαφήνιση της συλλογής VLP. Τα ίδια φίλτρα με ονομασίες πόρων 0.6μm και 0.3μm χρησιμοποιούνται για φιλτράρισμα σε κέντρα συγκομιδής VLP. Όλα τα διηθήματα που μελετήθηκαν δοκιμάστηκαν για ρυθμούς ανάκτησης HCV-VLP και συγκρίθηκαν οι συνιστώμενες μέθοδοι διήθησης. Τα αποτελέσματα φαίνονται στον Πίνακα 4.
Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι το φίλτρο 5μm-0.3μm είχε την υψηλότερη ανάκτηση προϊόντος (100%) για απευθείας συγκομιδή τροφών VLP ηπατίτιδας C. Το φίλτρο πολυπροπυλενίου 0,6μm είχε την υψηλότερη ανάκτηση προϊόντος (82%) για την κεντρική τροφοδοσία και η κάθαρση DNA του κυττάρου ξενιστή ήταν περίπου 70%.
2.2.1.4 Σωματίδια που μοιάζουν με ιούς που παράγονται σε συστήματα βακτηρίων ή ζυμομυκήτων
Ο τύπος της μεθόδου διαύγασης για τα εμβόλια VLP που εκφράζονται σε συστήματα βακτηρίων ή ζυμομυκήτων εξαρτάται από την απελευθέρωση του VLP σε εξωκυτταρικούς μεσολαβητές. Εάν τα VLP δεν μπορούν να εκκριθούν αποτελεσματικά, μπορεί να απαιτηθούν κυτταρική λύση ή άλλα στάδια εκχύλισης πριν από το πραγματικό βήμα διαύγασης. Ενώ αυτό είναι το χρυσό πρότυπο στη βιομηχανία διαύγασης πρωτεϊνών, η φυγοκέντρηση (συνεχής ή παρτίδα) που εκφράζεται σε βακτηριακά ή συστήματα με βάση ζυμομύκητες, πιο πρόσφατα, οι διεργασίες μεμβράνης έχουν γίνει μια πολύ ελκυστική εναλλακτική λύση λόγω της ευκολίας κλιμάκωσης και συμβατότητας με μία χρήση θεραπείες.
Οι Richter και Topell εξηγούν τη χρήση φυγοκέντρησης, TFF ή συνδυασμού και των δύο κατά την παρασκευή VLP που παράγονται σε διαυγασμένο E. coli. Στην εργασία τους, χρησιμοποιήθηκαν μεμβράνες 0.45 m TFF για την αραίωση και τη διαύγαση των ομογενοποιημένων ομογενοποιημένων προϊόντων E. coli σε θερμοκρασία 5 βαθμών. Σημειώνουν επίσης ότι το TFF με βάση τη μεμβράνη είναι κατάλληλο για το χειρισμό συγκομιδών υψηλού ιξώδους, κατά προτίμηση χρησιμοποιώντας μονάδες TFF με διαμορφώσεις ανοιχτού καναλιού.
Η φυγόκεντρη διαύγαση έχει επίσης αξιολογηθεί ως εναλλακτική λύση στο TFF. Σε αυτήν την περίπτωση, το ομογενοποίημα που προέκυψε δεν αραιώθηκε και φυγοκεντρήθηκε στους 4 βαθμούς για 105 λεπτά, 10000g. Χωρίς μεταφορά της μαλακής επικάλυψης, το υπερκείμενο χύθηκε από τα σωματίδια και φυγοκεντρήθηκε εκ νέου στους 4 βαθμούς και 10.000 g για 60 λεπτά. Το υπερκείμενο στη συνέχεια απομακρύνθηκε από τα παρόντα σωματίδια, αραιώθηκε με ρυθμιστικό διάλυμα ΕΒ (43,89 mM Tris HCl, 6,11 mM Tris Base, 5,0 mM EDTA, 10% (v/v) Triton X-100) 1:2, και διηθήθηκε σε αποστειρωμένη συσκευή φίλτρου 0,22 m. Περαιτέρω επεξεργασία. Η διαδικασία κλιμάκωσης για την παραγωγή αυτού του εμβολίου VLP σε E. coli σε κλίμακα 800L αποσαφηνίστηκε επίσης με τον συνδυασμό φυγοκέντρησης και TFF.
Το ανασυνδυασμένο εμβόλιο ηπατίτιδας Ε HEV 239 έχει λάβει άδεια στην Κίνα για ανοσοποίηση ενηλίκων 16 ετών και άνω. Τα αντιγόνα του εμβολίου (VLP) εκφράζονται στο E. coli και η κλιμάκωση της διαδικασίας παραγωγής αντιγόνου έχει αποδειχθεί ότι είναι σε κλίμακα 50L. Το προϊόν εκχυλίστηκε με πυρόλυση E. coli και τα έγκλειστα σώματα διαχωρίστηκαν από τα κυτταρικά θραύσματα με βαριά πλύση με ένα ρυθμιστικό που περιείχε 2% Triton Χ-100 και στη συνέχεια διαλύθηκαν με ομογενοποιητή ουρίας 4 Μ. Το TFF διευκρινίζει το VLP του ιού των ανθρωπίνων θηλωμάτων που παράγεται σε Saccharomyces cerevisiae (15L). Το κυτταρόλυμα που υποβλήθηκε σε επεξεργασία με νουκλεάση διαυγάστηκε με μικροδιήθηση εγκάρσιας ροής σε λειτουργία διήθησης χρησιμοποιώντας φίλτρο κοίλων ινών 0,65 μm. Η ίδια διαδικασία χρησιμοποιείται και στην παραγωγή εμβολίων. Αν και μόνο λίγα εμβόλια με βάση το VLP έχουν φτάσει σε εμπορική κλίμακα, αρκετά εμβόλια με βάση το VLP βρίσκονται σε ανάπτυξη, τα περισσότερα από τα οποία διαυγάζονται χρησιμοποιώντας τεχνολογία φυγοκέντρησης ή μεμβράνης.
Περιορισμένοι από την επίδραση του χώρου, θα μοιραστούμε το δεύτερο μισό του περιεχομένου στο επόμενο κεφάλαιο. Στο επόμενο άρθρο, θα μοιραστούμε ορισμένες περιπτώσεις διευκρίνισης του εμβολίου και χρήσης σχετικών συστατικών της μεμβράνης.
Ως η πρώτη εταιρεία στο κύκλωμα εντοπισμού, η Guidling Technology έχει συσσωρεύσει επαρκή σχετική εμπειρία στη διασαφήνιση εμβολίων. Η Guidling Technology είναι μια εταιρεία ανάπτυξης και παραγωγής που εστιάζει στη βιοφαρμακευτική και κυτταρική καλλιέργεια, τον καθαρισμό και τον διαχωρισμό. Τα προϊόντα χρησιμοποιούνται ευρέως στη βιοϊατρική, τη διάγνωση, τη βιομηχανική διήθηση υγρών, τη διαδικασία ανίχνευσης, διαύγασης, καθαρισμού και συγκέντρωσης. Η Guidling ανέπτυξε με επιτυχία σωλήνα φυγόκεντρου υπερδιήθησης, κασέτα μεμβράνης υπερδιήθησης/μικροδιήθησης, φίλτρο αφαίρεσης ιού, συσκευή φίλτρου εφαπτομενικής ροής, στοίβα βαθιάς μεμβράνης κ.λπ., που ανταποκρίνονται πλήρως στα σενάρια εφαρμογής της βιοφαρμακευτικής και κυτταρικής καλλιέργειας.
Οι μεμβράνες και τα φίλτρα μεμβράνης μας χρησιμοποιούνται ευρέως στη συμπύκνωση, την εκχύλιση και τον διαχωρισμό της προδιήθησης, της μικροδιήθησης, της υπερδιήθησης και της νανοδιήθησης. Η μεγάλη γκάμα σειρών προϊόντων μας, από μικρές εργαστηριακές διηθήσεις μίας χρήσης έως συστήματα φιλτραρίσματος τύπου παραγωγής, δοκιμές στειρότητας, ζύμωση, κυτταροκαλλιέργεια και άλλα, μπορεί να καλύψει τις ανάγκες δοκιμών και παραγωγής.
