Βασικές αρχές και ροή εργασίας της σύνθεσης πεπτιδίων στερεάς- φάσης (SPPS)

Πεπτιδική σύνθεση στερεάς-φάσης (SPPS)είναι μια μέθοδος για τη σύνθεση πεπτιδίων σε ένα στερεό υπόστρωμα. Οι κύριες στρατηγικές SPPS περιλαμβάνουν τοΜέθοδος Bocκαι τοΜέθοδος Fmoc. Η σύνθεση πεπτιδίων είναι μια επαναλαμβανόμενη διαδικασία διαδοχικής προσθήκης αμινοξέων και γενικά πραγματοποιείται απόΓ-άκρο (καρβοξυλικό άκρο)στοN-άκρο (αμινο άκρο). Πρώτον, η καρβοξυλική ομάδα του πρώτου αμινοξέος του πεπτιδίου στόχου συνδέεται ομοιοπολικά σε ένα στερεό υπόστρωμα (ρητίνη). Χρησιμοποιώντας την αμινομάδα αυτού του αμινοξέος ως σημείο εκκίνησης, η Ν-τελική προστατευτική ομάδα αφαιρείται και η αναπτυσσόμενη πεπτιδική αλυσίδα επιμηκύνεται με αντίδραση με περίσσεια ενός ενεργοποιημένου δεύτερου αμινοξέος. Αυτός ο κύκλος-σύζευξη → πλύσιμο → αποπροστασία → εξουδετέρωση και πλύσιμο → επόμενος σύνδεσμος-επαναλαμβάνεται μέχρι να επιτευχθεί το επιθυμητό μήκος πεπτιδίου. Τέλος, η πεπτιδική αλυσίδα αποκόπτεται από τη ρητίνη και καθαρίζεται για να ληφθεί το πεπτίδιο στόχος. Όταν η -αμινο ομάδα προστατεύεται μεBoc (τριτ-βουτυλοξυκαρβονύλιο), η μέθοδος αναφέρεται ωςΣύνθεση πεπτιδίων σε στερεά φάση-βασισμένη σε Boc. Όταν η -αμινο ομάδα προστατεύεται μεFmoc (9-φθορενυλομεθυλοξυκαρβονύλιο), είναι γνωστό ωςΣύνθεση πεπτιδίων σε στερεά φάση-βασισμένη σε Fmoc.

 

Σύνθεση πεπτιδίων σε στερεά φάση-με βάση το Boc (Μέθοδος Boc)

ΣτοΜέθοδος Boc, Ομάδες Boc αφαιρούμενες με τριφθοροξικό οξύ (TFA)χρησιμοποιούνται για την προστασία των -αμινο ομάδων, ενώπροστατευτικές ομάδες-τύπου βενζυλίουχρησιμοποιούνται για πλευρικές αλυσίδες. Κατά τη διάρκεια της σύνθεσης, ένα Boc-προστατευμένο -αμινοξύ συνδέεται πρώτα ομοιοπολικά με τη ρητίνη. Η ομάδα Boc στη συνέχεια απομακρύνεται με TFA και το προκύπτον ελεύθερο αμινο άκρο εξουδετερώνεται με τριαιθυλαμίνη. Το επόμενο αμινοξύ ενεργοποιείται χρησιμοποιώνταςDCC (δικυκλοεξυλοκαρβοδιιμίδιο)και συζεύχθηκε για να επεκτείνει την πεπτιδική αλυσίδα. Μετά την ολοκλήρωση της συναρμολόγησης, το πεπτίδιο στόχος αποκόπτεται από τη ρητίνη χρησιμοποιώντας ένα ισχυρό οξύ, τυπικάάνυδρο υδροφθόριο (HF)ήτριφθορομεθανοσουλφονικό οξύ (TFMSA)Στη μέθοδο σύνθεσης Boc, απαιτούνται επαναλαμβανόμενες επεξεργασίες με οξύ για την απομάκρυνση των προστατευτικών ομάδων πριν από κάθε στάδιο σύζευξης. Αυτό μπορεί να οδηγήσει σε διάφορες παράπλευρες αντιδράσεις, όπως πρόωρη διάσπαση του πεπτιδίου από τη ρητίνη και αστάθεια των πλευρικών αλυσίδων αμινοξέων υπό όξινες συνθήκες, με αποτέλεσμα ανεπιθύμητες παρενέργειες.

 

Σύνθεση πεπτιδίων σε στερεά φάση-με βάση Fmoc (μέθοδος Fmoc)

Σε1978, Meienhofer και Athertonανέπτυξε μια στρατηγική σύνθεσης πεπτιδίων χρησιμοποιώνταςFmoc (9-φθορενυλομεθυλοξυκαρβονύλιο)ως -αμινοπροστατευτική ομάδα, γνωστή ως τοΜέθοδος Fmoc. Σε αυτήν την προσέγγιση, η -αμινο ομάδα προστατεύεται μεβάσης-αστάθειας Fmoc, ενώ οι πλαϊνές αλυσίδες προστατεύονται μεπροστατευτικές ομάδες τύπου οξέος-αστάθειας Boc-.Ένα σημαντικό πλεονέκτημα του Fmoc ως αμινο-προστατευτικής ομάδας είναισταθερότητα υπό όξινες συνθήκες; δεν επηρεάζεται από τη θεραπεία με αντιδραστήρια όπως π.χτριφθοροξικό οξύ (TFA)και μπορεί να αφαιρεθεί επιλεκτικά χρησιμοποιώνταςήπια βάση. Ταυτόχρονα, οι ομάδες προστασίας πλευρικής-αλυσίδας όπως το Boc είναι σταθερές υπό βασικές συνθήκες και αφαιρούνται υπό όξινη επεξεργασία. Τέλος, το πεπτίδιο αποκόπτεται ποσοτικά από τη ρητίνη χρησιμοποιώνταςTFA/διχλωρομεθάνιο (DCM), αποφεύγοντας τη χρήση ισχυρών οξέων και συνεπώς βελτιώνοντας την ασφάλεια και τη συμβατότητα με την τακτική σύνθεση πεπτιδίων.

 

Ιστορικό ανάπτυξης της σύνθεσης πεπτιδίων στερεάς-φάσης (SPPS)

1. Θεμελιώδες στάδιο (αρχές 20ου αιώνα έως 1963)

Σε1902, Έμιλ Φίσερήταν ο πρώτος που διερεύνησε τη σύνθεση πεπτιδίων, αλλά η πρόοδος ήταν αργή λόγω τεχνικών περιορισμών. Πρώιμες συνθέσεις που χρησιμοποιούνταιπροστατευτικές ομάδες βενζοϋλίου και ακετυλίου, που ήταν δύσκολο να αφαιρεθούν και συχνά οδηγούσαν σεδιάσπαση πεπτιδικής αλυσίδας.

Σε1932, Μαξ Μπέργκμανκαι οι συνάδελφοι-παρουσίασαν τοομάδα βενζυλοξυκαρβονυλίου (Ζ).ως -αμινοπροστατευτική ομάδα. Αυτή η ομάδα θα μπορούσε να αφαιρεθεί κάτω απόκαταλυτική υδρογόνωση ή όξινες συνθήκες, παρέχοντας ένα πιο αξιόπιστο εργαλείο για τη σύνθεση πεπτιδίων και θέτοντας τα θεμέλια για την ανάπτυξη της σύνθεσης πεπτιδίων στερεάς-φάσης στη δεκαετία του 1960.

Κατά τη διάρκεια του1950s, οι επιστήμονες συνέθεσαν με επιτυχία μια ποικιλία απόβιολογικά ενεργά πεπτίδια, όπωςωκυτοκίνη και ινσουλίνη. Αυτά τα επιτεύγματα προώθησαν περαιτέρω τη χημεία των πεπτιδίων και έθεσαν τα θεμέλια για την εμφάνιση της σύνθεσης πεπτιδίων στερεάς- φάσης.

 

2. Πρωτοποριακή Σκηνή (1963)

Σε1963, Robert B. Merrifieldπρότεινε τομέθοδος σύνθεσης πεπτιδίων στερεάς-φάσης (SPPS)., στην οποία ηC-τελικό αμινοξύαγκυρώνεται σε ένα στήριγμα ρητίνης και η πεπτιδική αλυσίδα επιμηκύνεται μέσω επαναλαμβανόμενων κύκλωναποπροστασία και σύζευξη. Αυτή η προσέγγιση απλοποίησε σημαντικά τη διαδικασία σύνθεσης πεπτιδίων και έγινε ηπροτιμώμενη μέθοδοςγια συγκρότηση πεπτιδίων.

Merrifield που χρησιμοποιείταιBoc (τριτ-βουτυλοξυκαρβονύλιο)για την προστασία της -αμινοομάδας. Στα τέλη της δεκαετίας του 1960, ανέπτυξε επίσης τοπρώτος πλήρως αυτοματοποιημένος συνθέτης πεπτιδίωνκαι συντέθηκαν με επιτυχίαβιολογικές πρωτεΐνεςόπωςριβονουκλεάση (124 αμινοξέα). Για αυτά τα πρωτοποριακά επιτεύγματα, στο Merrifield απονεμήθηκε τοΒραβείο Νόμπελ Χημείας το 1984.

 

3. Στάδιο Τεχνολογικής Καινοτομίας (1972)

Σε1972, Λου Καρπίνοανέπτυξε τοΠροστατευτική ομάδα 9-φθορενυλμεθυλοξυκαρβονυλίου (Fmoc)., που μπορεί να είναιαφαιρείται απαλά υπό βασικές συνθήκες, μειώνοντας τις παρενέργειες. Αυτό το έκανε ιδιαίτερα κατάλληλο γιασύνθετα πεπτίδιακαιαυτοματοποιημένη σύνθεση.

ΟΜέθοδος Fmocαντικατέστησε σταδιακά τη μέθοδο Boc ως κύρια στρατηγική. Αυτοματοποιημένοι συνθέτες πεπτιδίων που βασίζονται και στα δύοFmoc και Boc χημείααναπτύχθηκαν στη συνέχεια, οδηγώντας τοαυτοματοποίηση της σύνθεσης πεπτιδίωνκαι βελτιώνει σημαντικά την αποτελεσματικότητα και την αναπαραγωγιμότητα.

 

4. Στάδιο ωρίμανσης και επέκτασης (από τη δεκαετία του 1990 έως σήμερα)

Βελτιστοποίηση ρητίνης και αντιδραστηρίου:Ανάπτυξη τουυψηλής-φόρτωσης, υδρόφιλες ρητίνες PEG-τροποποιημένεςκαι αποτελεσματικά αντιδραστήρια σύζευξης όπωςHBTUκαιHATUέχει βελτιώσει σημαντικά την αποτελεσματικότητα και την απόδοση της σύνθεσης πεπτιδίων στερεάς-φάσης (SPPS).

Τεχνολογική Ολοκλήρωση:Νέες προσεγγίσεις όπωςσύνθεση με τη βοήθεια μικροκυμάτων-καιχημεία ροήςέχουν συντομεύσει τους χρόνους αντίδρασης και αύξησαν περαιτέρω τις αποδόσεις.

 

Βασικές αρχές και ροή εργασίας του SPPS:
Η βασική αρχή της σύνθεσης πεπτιδίων στερεάς- φάσης είναι ησταδιακή κατασκευή μιας πεπτιδικής αλυσίδας σε ένα στερεό υπόστρωμα, χρησιμοποιώνταςστρατηγικές προστασίας της ομάδαςκαιαντιδράσεις συμπύκνωσης (σύζευξης).να επιτύχειαποτελεσματική και ελεγχόμενη διάταξη πεπτιδίου.

1.Ρόλος της Στερεής Υποστήριξης (Ρητίνη) στη Σύνθεση Πεπτιδίων Στερεάς-Φάσης (SPPS)

A αδιάλυτη πολυμερική ρητίνη-όπωςπολυστυρένιο-διβινυλοβενζόλιο-διασταυρωμένη ρητίνη, ρητίνη Wang ή ρητίνη αμιδίου RinkΤο -επιλέγεται ως σταθερή υποστήριξη στο SPPS. Η επιφάνεια της ρητίνης περιέχειλειτουργικές ομάδες(π.χ. υδροξυλικές ή αμινο ομάδες) που μπορούν να σχηματιστούνομοιοπολικούς δεσμούς με το ένα άκρο της πεπτιδικής αλυσίδας, συνήθως τοC-τερματικό, αγκυρώνοντας το πεπτίδιο στο στερεό στήριγμα. Αυτή η ομοιοπολική προσάρτηση διασφαλίζει ότι το αναπτυσσόμενο πεπτίδιοπαραμένει συνδεδεμένο με τη ρητίνη καθ' όλη τη διάρκεια της σύνθεσης, που σε μεγάλο βαθμόδιευκολύνει τα επόμενα στάδια αντίδρασης, το πλύσιμο και τον καθαρισμό

 

2. Προστασία της στρατηγικής ομάδας στη σύνθεση πεπτιδίων στερεάς- φάσης (SPPS)

Κατά τη σύνθεση πεπτιδίων, το-αμινο ομάδα, ομάδα καρβοξυλίου και δραστική πλευρική-αλυσίδα λειτουργικές ομάδεςαμινοξέων (όπως θειόλη, καρβοξυλ και αμινο ομάδες) είναι επιρρεπείς σεπαράπλευρες αντιδράσεις. Για την πρόληψη αυτών των ανεπιθύμητων αντιδράσεων,προστατευτικές ομάδεςχρησιμοποιούνται. Οι κοινές προστατευτικές ομάδες περιλαμβάνουν:-Ομάδες προστασίας Amino:

Boc (τριτ-βουτυλοξυκαρβονύλιο):Οξύ-ασταθής, αφαιρείται εύκολα από κάτωόξινες συνθήκες.

Fmoc (9-φθορενυλομεθυλοξυκαρβονύλιο):Σταθερό σε όξινες συνθήκες, μπορεί να αφαιρεθεί κάτω απόβασικές προϋποθέσεις(π.χ. διάλυμα πιπεριδίνης/DMF).Πλαϊνή-Ομάδες προστασίας αλυσίδας:Επιλέγεται σύμφωνα με τις χημικές ιδιότητες της πλευρικής αλυσίδας αμινοξέων.Οι κοινές ομάδες περιλαμβάνουνβενζύλιο (Bn), τριτ-βουτύλιο (tBu), τριτύλιο (Trt), κλπ. Αυτές οι ομάδες είναιαφαιρείται στο τέλος της σύνθεσης, συνήθως κατά τη διάσπαση του πεπτιδίου από τη ρητίνη, χρησιμοποιώνταςοξύ ή άλλες ειδικές συνθήκες.

 

3.C-Terminus to N-Terminus Synthesis στο SPPS

Σεσύνθεση πεπτιδίων στερεάς-φάσης (SPPS), η συναρμολόγηση πεπτιδίου συνήθως αρχίζει στοΓ-άκρο (καρβοξυλικό άκρο)και προχωρά σταδιακά προς τοN-άκρο (αμινο άκρο). Αυτό συμβαίνει επειδή τοΤο C-τελικό αμινοξύ συνδέεται πρώτα στο στερεό στήριγμακαι τα επόμενα αμινοξέα συζεύγνυνται με τοελεύθερη αμινομάδα της πεπτιδικής αλυσίδας που είναι ήδη συνδεδεμένη με τη ρητίνη, επιμηκύνοντας σταδιακά την πεπτιδική αλυσίδα.

 

4. Αντίδραση σύζευξης στη σύνθεση πεπτιδίων στερεάς- φάσης (SPPS)

Τα προστατευμένα αμινοξέα πρέπει να είναιενεργοποιήθηκεώστε τουςοι καρβοξυλικές ομάδες γίνονται αντιδραστικές, επιτρέποντάς τους να σχηματίσουν έναπεπτιδικός δεσμόςμε την αμινομάδα του δεσμευμένου πεπτιδίου με ρητίνη-. Κοινόςαντιδραστήρια ενεργοποίησηςσυμπεριλαμβάνωκαρβοδιιμίδια(π.χ. DCC, DIC),HOBt, HATU, καιPyBOP. Μόλις ενεργοποιηθεί, η καρβοξυλική ομάδα αντιδρά με την ελεύθερη αμινομάδα στο ααντίδραση συμπύκνωσης, σχηματίζοντας ένααμιδικός δεσμόςκαι έτσι συνδέει το νέο αμινοξύ στην αναπτυσσόμενη πεπτιδική αλυσίδα.

 

5.Επαναλαμβανόμενες (Κυκλικές) Λειτουργίες στη Σύνθεση Πεπτιδίων Στερεάς-Φάσης (SPPS)

Η διαδικασία περιλαμβάνειεπανάληψη του κύκλου αποπροστασίας → σύζευξη → πλύση, προσθέτονταςένα αμινοξύ ανά κύκλονα επιμηκύνει σταδιακά την πεπτιδική αλυσίδα. Μετά από κάθεαντίδραση σύζευξης, η ρητίνη είναιπλυμένο(π.χ., με διαλύτες όπως DMF ή DCM) για την απομάκρυνση αντιδραστηρίων που δεν αντέδρασαν, από-προϊόντα και περίσσεια αμινοξέων. ΟΗ -αμινο ομάδα του υπολείμματος που προστέθηκε πρόσφατα αποπροστατεύεται, εκθέτοντας μια ελεύθερη αμίνη για να προετοιμαστεί για την επόμενη αντίδραση σύζευξης. Αυτός ο κύκλος επαναλαμβάνεται μέχρι να συναρμολογηθεί πλήρως η επιθυμητή πεπτιδική αλληλουχία.

 

6. Διάσπαση σε στερεά-Πεπτιδική Σύνθεση Φάσης (SPPS)

Μόλις η πεπτιδική αλυσίδα φτάσει στο επιθυμητό μήκος, είναιαποκομμένο από το συμπαγές στήριγμαχρησιμοποιώντας κατάλληλο αντιδραστήριο, ενώ ταυτόχρονααφαιρώντας όλες τις προστατευτικές ομάδες. Ένα συνήθως χρησιμοποιούμενο αντιδραστήριο διάσπασης είναιτριφθοροξικό οξύ (TFA), που όχι μόνοσπάει τον δεσμό μεταξύ του πεπτιδίου και της ρητίνηςαλλά καιαφαιρεί τις προστατευτικές ομάδεςόπως το Fmoc και το Boc, επαναφέροντας το πεπτίδιο σε αυτόεγγενής πολιτεία. Μόλις η πεπτιδική αλυσίδα φτάσει στο επιθυμητό μήκος, είναιαποκομμένο από το συμπαγές στήριγμαχρησιμοποιώντας κατάλληλο αντιδραστήριο, ενώ ταυτόχρονααφαιρώντας όλες τις προστατευτικές ομάδες. Ένα συνήθως χρησιμοποιούμενο αντιδραστήριο διάσπασης είναιτριφθοροξικό οξύ (TFA), που όχι μόνοσπάει τον δεσμό μεταξύ του πεπτιδίου και της ρητίνηςαλλά καιαφαιρεί τις προστατευτικές ομάδεςόπως το Fmoc και το Boc, επαναφέροντας το πεπτίδιο σε αυτόεγγενής πολιτεία.

Μέσα από αυτά τα βήματα,σύνθεση πεπτιδίων στερεάς-φάσης (SPPS)επιτρέπει τηναποτελεσματική και ελεγχόμενη συναρμολόγηση πεπτιδικών αλυσίδων σε στερεό στήριγμα, αποφεύγοντας τα περίπλοκα ενδιάμεσα βήματα καθαρισμού που απαιτούνται στην παραδοσιακή σύνθεση φάσης-διαλύσεων και σημαντικάβελτίωση της αποτελεσματικότητας και της απόδοσης της σύνθεσης.

Μέσα από αυτά τα βήματα,σύνθεση πεπτιδίων στερεάς-φάσης (SPPS)επιτρέπει τηναποτελεσματική και ελεγχόμενη συναρμολόγηση πεπτιδικών αλυσίδων σε στερεό στήριγμα, αποφεύγοντας τα περίπλοκα ενδιάμεσα βήματα καθαρισμού που απαιτούνται στην παραδοσιακή σύνθεση φάσης-διαλύσεων και σημαντικάβελτίωση της αποτελεσματικότητας και της απόδοσης της σύνθεσης.