Πώς να επιλέξετε τον κατάλληλο σωλήνα υπερδιήθησης
Οι σωλήνες υπερδιήθησης που χρησιμοποιούνται συνήθως για τη συγκέντρωση πρωτεΐνης και την αντικατάσταση του ρυθμιστικού διαλύματος χρησιμοποιούνται συχνά σε σωλήνες υπερδιήθησης. Υπάρχουν άλλα μοντέλα, τα οποία έχουν διαφορετικά μεγέθη όγκου και σωλήνες υπερδιήθησης, ανάλογα με το μοριακό βάρος της πρωτεΐνης στόχου, τον όγκο πριν από τη συγκέντρωση και τον όγκο στόχο συγκέντρωσης. Επαναχρησιμοποιήσιμο.
1. Επιλέξτε έναν κατάλληλο σωλήνα υπερδιήθησης, λαμβάνοντας κυρίως υπόψη το MWCO και τον όγκο συγκέντρωσης. Γενικά, το μοριακό βάρος δεν πρέπει να είναι μεγαλύτερο από το 1/3 του μοριακού βάρους της πρωτεΐνης στόχου. Εάν το μοριακό βάρος της πρωτεΐνης στόχου είναι περίπου 10 kd, μπορεί να χρησιμοποιηθεί ένας σωλήνας υπερδιήθησης με διατηρημένο μοριακό βάρος 3 KD.
2. Το υπερδιήθημα που αγοράστηκε πρόσφατα είναι στεγνό. Προσθέστε milliq νερό πριν από τη χρήση. Το νερό περνάει εντελώς μέσα από τη μεμβράνη και προψύχεται σε παγόλουτρο ή ψυγείο για λίγα λεπτά. Στη συνέχεια, αδειάστε το νερό για να προσθέσετε το διάλυμα πρωτεΐνης. Η ποσότητα του διαλύματος πρωτεΐνης δεν πρέπει να υπερβαίνει τη λευκή γραμμή στο επάνω μέρος του δοκιμαστικού σωλήνα. Εύκολη λειτουργία. Πριν από την προσθήκη του διαλύματος πρωτεΐνης, ο σωλήνας υπερδιήθησης πρέπει να εισαχθεί στον πάγο για προψύξη.
3. Ισορροπία. Η μάζα και το κέντρο βάρους πρέπει να είναι ισορροπημένα. Σημειώστε ότι η ταχύτητα και η επιτάχυνση δεν πρέπει να είναι πολύ γρήγορες, διαφορετικά η μεμβράνη υπερδιήθησης θα καταστραφεί άμεσα. Ξεκινήστε τη φυγόκεντρο υπερδιήθηση (προψύξη της φυγόκεντρου στους 4 βαθμούς). Η κατεύθυνση του διαφράγματος και του περιστρεφόμενου άξονα μπορούν να ρυθμιστούν σύμφωνα με τις οδηγίες (στην περίπτωση της φυγόκεντρου γωνίας, το διάφραγμα είναι κάθετο στον άξονα). Στην πραγματική χρήση, η γενική ταχύτητα είναι χαμηλότερη από αυτή που καθορίζεται στο εγχειρίδιο, γεγονός που μπορεί να παρατείνει τη διάρκεια ζωής του φυγοκεντρικού σωλήνα.
4. όταν συμπυκνωθεί στο υπόλοιπο 1 ml, [πάρτε το οικιακό διάλυμα Bradford 50 ul, προσθέστε 10 ul υγρού για να δείτε εάν γίνεται μπλε και προσδιορίστε εάν ο σωλήνας υπερδιήθησης διαρρέει την πρωτεΐνη. Εάν ο σωλήνας έχει διαρροή, χύστε τον στο ανώτερο στρώμα και μετά ρίξτε πίσω στον νέο σωλήνα για να ξεκινήσει η υπερδιήθηση. Για να προσδιορίσετε με ακρίβεια εάν ο δοκιμαστικός σωλήνας παρουσιάζει διαρροή, παρακαλούμε φυγοκεντρήστε 5 mg 10 λεπτών για 10 λεπτά, μετά περάστε το, περάστε το πρωτεϊνικό τζελ ή Bradford] [χονδρική μέτρηση]. Συνεχίστε να προσθέτετε το υπόλοιπο διάλυμα πρωτεΐνης για συμπύκνωση (λειτουργήστε σε πάγο για να αποτρέψετε τη θέρμανση της πρωτεΐνης) μέχρι να προστεθούν όλα τα συμπυκνωμένα διαλύματα. Κατά τη διάρκεια της φυγοκέντρησης, προσέξτε εάν συμβαίνει καθίζηση πρωτεΐνης και προκαλεί απόφραξη του σωλήνα. Εάν συμβεί καθίζηση, προσδιορίστε τη συγκεκριμένη αιτία της καθίζησης, εάν η συγκέντρωση πρωτεΐνης είναι πολύ υψηλή ή εάν το ρυθμιστικό διάλυμα είναι ακατάλληλο. Το πρώτο μπορεί να λυθεί χρησιμοποιώντας πολλαπλούς σωλήνες υπερδιήθησης ταυτόχρονα για να μειωθεί η συγκέντρωση, ενώ το δεύτερο μπορεί να αλλάξει διαφορετικά ρυθμιστικά διαλύματα μέχρι να κατακρημνιστεί η πρωτεΐνη.
5. Τα προηγούμενα βήματα χρησιμοποιούνται για τη συμπύκνωση πρωτεΐνης. Εάν το ρυθμιστικό διάλυμα πρόκειται να αντικατασταθεί, όταν το ολικό διάλυμα πρωτεΐνης συμπυκνωθεί σε περίπου 1 ml, προσθέστε απαλά ένα νέο ρυθμιστικό διάλυμα (υπερδιήθηση μέσω μεμβράνης υπερδιήθησης). ότι η τελική συγκέντρωση εξαρτάται από την απαιτούμενη συγκέντρωση πρωτεΐνης, η οποία συνήθως δεν είναι μεγαλύτερη από 500ul ή μικρότερη από 200ul. Σύμφωνα με τη συγκέντρωση όγκου τουλάχιστον 10 φορές κάθε φορά, είναι περισσότερο από 1000 φορές μεγαλύτερη από αυτή του τριπλάσιου, πράγμα που μπορεί βασικά να επιτύχει τον σκοπό της αλλαγής του buffer.
6. Αφαιρέστε το τελικό συμπύκνωμα πρωτεΐνης. Λειτουργήστε στον πάγο. Χρησιμοποιώντας ένα κίτρινο άκρο πιπέτας (200 ul), τοποθετήστε απαλά το άκρο της πιπέτας κατά μήκος της άκρης, στη συνέχεια φυσήξτε απαλά και αναμείξτε το διάλυμα πρωτεΐνης. Προσέξτε να μην αγγίξετε τη μεμβράνη υπερδιήθησης. Αναρροφήστε το συμπυκνωμένο διάλυμα σε 200 ul κάθε φορά μέχρι να αναρροφηθεί πλήρως. Δεν είναι απαραίτητο να εκχυλίσετε το τελευταίο συμπυκνωμένο διάλυμα στον πυθμένα του δοκιμαστικού σωλήνα, διαφορετικά είναι πολύ δύσκολο και μπορεί να καταστραφεί η μεμβράνη υπερδιήθησης. Τέλος, νερό milliq προστίθεται στον σωλήνα υπερδιήθησης χωρίς να περάσει από τη μεμβράνη υπερδιήθησης για να αποτραπεί η απώλεια νερού και η ξήρανση της μεμβράνης.
7. Τα παρακάτω είναι τα βήματα για την επεξεργασία του σωλήνα υπερδιήθησης και την επαναχρησιμοποίηση του σωλήνα υπερδιήθησης.
8. Ρίξτε νερό στο σωληνάριο υπερδιήθησης και ξεπλύνετε απαλά με milliq νερό για αρκετές φορές. [εάν υπάρχει εμφανής κατακρήμνιση πρωτεΐνης στο κάτω μέρος του δοκιμαστικού σωλήνα, μπορείτε να προσθέσετε πρώτα νερό και μετά να το φυσήξετε με μια πιπέτα. Προσέξτε να μην αγγίξετε τη μεμβράνη. Το ίζημα κρέμεται και μετά τρέχει μακριά. Δεν μπορείτε να το ξεπλύνετε με νερό βρύσης. Αφού προσθέσετε 0,2 m διαλύματος NaOH, τοποθετήστε το σε θερμοκρασία δωματίου για 20 λεπτά και ισορροπήστε τον σωλήνα υπερδιήθησης κατά τη διάρκεια αυτής της περιόδου. Φυγοκεντρήστε για άλλα 10 λεπτά. Αδειάστε το υπόλοιπο διάλυμα NaOH και βυθίστε τον πυρήνα βαμβακιού στο ποτήρι ζέσεως (1 ή 2 L) Milliq νερό, τοποθετημένο για αρκετές ώρες, και στη συνέχεια αντικαταστήστε με νέο νερό, τοποθετημένο για αρκετές ώρες για να αραιώσει συνεχώς η συγκέντρωση του NaOH. Πλύνετε το δοκιμαστικό σωλήνα των 50 ml και καλύψτε με νερό βρύσης και πλύνετε το εσωτερικό τοίχωμα με milliq νερό.
9. Βγάλτε τον βυθισμένο πυρήνα του δοκιμαστικού σωλήνα, προσθέστε τον στο πλήρες νερό του milliq και, στη συνέχεια, γεμίστε τον δοκιμαστικό σωλήνα των 50 ml με νερό milliq. Βάλτε αργά τον πυρήνα του σωλήνα σε 50 ml.
Φυγοκεντρήστε το σωλήνα, στραγγίστε και διαιρέστε το νερό, στη συνέχεια καλύψτε και αποθηκεύστε στους 4 βαθμούς μέχρι την επόμενη χρήση. Σε γενικές γραμμές, σύμφωνα με τα παραπάνω βήματα και προφυλάξεις, κάθε σωλήνας δεν θα σπάσει μέσα σε τρία ή τέσσερα χρόνια.
