Διαδικασία συγκέντρωσης υπερδιήθησης/διαδιήθησης: Πώς να αποτρέψετε αποτελεσματικά τη διείσδυση και την απώλεια πρωτεϊνών-στόχων
Μεταγενέστερη διαδικασία συγκέντρωσης υπερδιήθησης/διαδιήθησης: Πώς να αποτρέψετε αποτελεσματικά τη διείσδυση και την απώλεια πρωτεΐνης στόχου
Σε διαδικασίες καθαρισμού κατάντη για ανασυνδυασμένες πρωτεΐνες, προϊόντα αίματος και άλλα βιολογικά, η υπερδιήθηση/διαδιήθηση (UF/DF) χρησιμοποιείται για τη συγκέντρωση πρώτης ύλης, την ανταλλαγή ρυθμιστικού διαλύματος και την απομάκρυνση αλάτων και μικρών-μοριακών ακαθαρσιών. Ο διαχωρισμός επιτυγχάνεται με βάση το κοσκίνισμα μεμβράνης: μεγάλα μόρια όπως τα μονοκλωνικά αντισώματα (mAbs) διατηρούνται από τη μεμβράνη, ενώ άλατα, ενδοτοξίνες, πρωτεΐνες ελεύθερων κυττάρων ξενιστών (HCPs) και άλλες ακαθαρσίες μικρών μορίων περνούν από τη μεμβράνη και απομακρύνονται στο διήθημα. Κατά τη διάρκεια της ανόδου της διαδικασίας-, η απώλεια πρωτεΐνης στόχου μέσω της μεμβράνης μπορεί εύκολα να συμβεί, μειώνοντας άμεσα την απόδοση και αυξάνοντας το κόστος παρτίδας. Σε ορισμένες συνθήκες λειτουργίας, η πρωτεΐνη μπορεί να ανιχνευθεί στο διήθημα, που απαιτεί γρήγορο προσδιορισμό του εάν τα διαρροή συστατικά είναι άθικτα mAb στόχου, αποικοδομημένα/τεμαχισμένα συσσωματώματα ή πρωτεΐνες κυττάρου ξενιστή. Αυτό το άρθρο χωρίζεται σε δύο κύρια μέρη: εξετάζει τις παραδοσιακές προσεγγίσεις ελέγχου-διεργασιών και, σε συνδυασμό με το Σχεδιασμό πειραμάτων (DOE), δημιουργεί ένα ισχυρό παράθυρο διαδικασίας, που υποστηρίζεται από πολλαπλές αναλυτικές μεθόδους για τον προσδιορισμό της ταυτότητας των πρωτεϊνών που ανιχνεύονται στο διήθημα.
I. Βασικές αιτίες της διείσδυσης της πρωτεΐνης στόχου μέσω της μεμβράνης κατά τη διάρκεια της UF/DF
1. Υπερβολική διαμεμβρανική πίεση (TMP)
Όταν η διαφορά πίεσης κατά μήκος της μεμβράνης είναι πολύ υψηλή, η αντίσταση του διαλύτη ενισχύεται, αναγκάζοντας κάποια μονομερή πρωτεΐνη στο διήθημα. Κατά την κλίμακα-επάνω, η δεξαμενή τροφοδοσίας περιέχει μεγαλύτερο όγκο υλικού και οι διακυμάνσεις της πίεσης στις σωληνώσεις είναι πιο έντονες, καθιστώντας την παροδική υπερπίεση πιο πιθανή από ό,τι σε εργαστηριακή κλίμακα.
2. Ακατάλληλη εφαπτομενική ροή
Εάν ο ρυθμός ροής είναι πολύ χαμηλός, σχηματίζεται ένα στρώμα πόλωσης- πυκνής συγκέντρωσης στην επιφάνεια της μεμβράνης και η τοπική συγκέντρωση πρωτεΐνης μπορεί να υπερβεί το όριο ανοχής της μεμβράνης. Εάν ο ρυθμός ροής είναι πολύ υψηλός, η διατμητική τάση μπορεί να προκαλέσει δομική διάσπαση του mAb, δημιουργώντας μικρότερα θραύσματα πρωτεΐνης που μπορούν να περάσουν ελεύθερα μέσα από τους πόρους της μεμβράνης.
3. Υπερβολικά υψηλή συγκέντρωση πρωτεΐνης στην πρώτη ύλη
Όταν η συγκέντρωση πρωτεΐνης στην τροφή είναι πολύ υψηλή, η πρωτεΐνη συσσωρεύεται στην επιφάνεια της μεμβράνης και κάποια μονομερής πρωτεΐνη μπορεί να μεταφερθεί στο διήθημα. Αυτό είναι ένα κοινό πρόβλημα στην παραγωγή μεγάλης- κλίμακας.
4. pH ή αγωγιμότητα εκτός του εύρους της διεργασίας
Οι αλλαγές στα χαρακτηριστικά φορτίου της πρωτεΐνης μπορούν να μειώσουν την ακτίνα ενυδάτωσης και το φαινομενικό μέγεθος σωματιδίων, με αποτέλεσμα τη μη φυσιολογική διείσδυση της μεμβράνης.
5. Γήρανση κασέτας μεμβράνης, υψηλή ροή διάχυσης ή ανεπαρκής προ- προετοιμασία
Φυσικά ελαττώματα στην κασέτα μεμβράνης μπορεί να προκαλέσουν άμεσα διαρροή πρωτεΐνης και να αντιπροσωπεύουν κίνδυνο που σχετίζεται με τον εξοπλισμό. Το επαναλαμβανόμενο CIP με έντονα αλκαλικά διαλύματα μπορεί σταδιακά να βλάψει το υλικό της μεμβράνης πολυαιθεροσουλφόνης (PES).
6. Υπερβολικός όγκος διαδιήθησης
Κατά τη διάρκεια παρατεταμένης διαδιήθησης, η συνεχής έκπλυση με διαλύτη μπορεί σταδιακά να απομακρύνει μικρές ποσότητες μονομερούς πρωτεΐνης.
II. Παραδοσιακά πρακτικά μέτρα για την πρόληψη της διείσδυσης και της απώλειας πρωτεϊνών-στόχων
(Α) Έλεγχος παραμέτρων διεργασίας
1. Έλεγχος διαμεμβρανικής πίεσης (TMP)
Καθορίστε ένα ανώτερο προειδοποιητικό όριο πίεσης και δημιουργήστε συναγερμούς αλληλασφάλισης για να αποτρέψετε παροδικές επιπτώσεις υψηλής- πίεσης στο στρώμα μεμβράνης. Αφού προσδιορίσετε τις βασικές παραμέτρους σε μικρή κλίμακα, μειώστε την ασφαλή πίεση λειτουργίας κατά την-αναβάθμιση της παραγωγής και κρατήστε ένα κατάλληλο εύρος ανοχής διαδικασίας.
2. Βελτιστοποιήστε τον ρυθμό διασταυρούμενης ροής
Δημιουργήστε ένα σταθερό οριακό στρώμα και μειώστε την πόλωση της συγκέντρωσης στην επιφάνεια της μεμβράνης μέσω της εγκάρσιας ροής, ελαχιστοποιώντας έτσι τη συσσώρευση πρωτεΐνης στην επιφάνεια της μεμβράνης στην πηγή.
3. Περιορίστε την τελική συγκέντρωση μετά τη συμπύκνωση
Καθορίστε ένα όριο συγκέντρωσης με βάση τις φυσικοχημικές ιδιότητες της πρωτεΐνης και αποφύγετε την υπερβολική συγκέντρωση τροφής. Για τα mAbs, η τελική συγκέντρωση ρουτίνας γενικά δεν υπερβαίνει τα 50 mg/mL. για ορισμένα mAbs που είναι επιρρεπή σε συσσωμάτωση, η συγκέντρωση θα πρέπει να μειωθεί περαιτέρω.
4. Ελέγξτε το pH και την αγωγιμότητα της τροφοδοσίας
Διατηρήστε ένα σταθερό μέγεθος ενυδατωμένου σωματιδίου της πρωτεΐνης και αποφύγετε τη μοριακή συστολή που προκαλείται από διαταραχές οξέος/βάσης ή ιοντικής- ισχύος.
(Β) Εξοπλισμός και Λειτουργικοί Έλεγχοι
1. Πραγματοποιήστε έλεγχο ακεραιότητας κασέτας μεμβράνης πριν από κάθε παρτίδα
Πραγματοποιήστε μια δοκιμή φυσαλίδων-πριν από την παραγωγή κάθε παρτίδας για να εντοπίσετε σπασμένες ίνες μεμβράνης. Οι κατεστραμμένες κασέτες μεμβράνης θα πρέπει να απορρίπτονται αμέσως για να αποφευχθεί η συνεχής διαρροή πρωτεΐνης.
2. Τυποποιήστε τη διαδικασία καθαρισμού CIP
Ελέγξτε τη συγκέντρωση NaOH και τον χρόνο επαφής. Μετά από ισχυρά αλκαλικό καθαρισμό, εξισορροπήστε πλήρως το υλικό της μεμβράνης για να μειώσετε τον κίνδυνο παραμόρφωσης των πόρων της μεμβράνης.
3. Χρησιμοποιήστε σταδιακή διαδιήθηση
Χρησιμοποιήστε μια-ανταλλαγή ρυθμιστικού διαλύματος μεγάλου όγκου κατά το αρχικό στάδιο για να αφαιρέσετε τα άλατα και επιβραδύνετε τον ρυθμό ροής διαδιήθησης καθώς πλησιάζει το τελικό σημείο για να μειώσετε την οπισθέλκουσα και την απώλεια πρωτεΐνης.
III. Δημιουργία χώρου σχεδίασης διαδικασίας μέσω DOE (Χαρακτηρισμός διαδικασίας QbD, Ισχύει για υποβολή IND)
1. Έλεγχος παραγόντων
Οθόνη πέντε βασικών παραμέτρων διεργασίας UF/DF (P): διαμεμβρανική πίεση, ρυθμός ροής τροφοδοσίας, αρχική συγκέντρωση πρωτεΐνης, pH τροφοδοσίας και θερμοκρασία λειτουργίας.
Μεταβλητές απόκρισης: διατηρούμενη απόδοση, περιεκτικότητα πρωτεΐνης στο διήθημα, ροή μεμβράνης και ποσοστό συσσωματωμάτων υψηλού-μοριακού- βάρους.
Μέσω της ανάλυσης σημαντικότητας, εντοπίστε τους βασικούς παράγοντες που συμβάλλουν στη διαρροή πρωτεΐνης.
2. Μοντελοποίηση επιφάνειας απόκρισης
Επιλέξτε τις τέσσερις παραμέτρους με την υψηλότερη σημασία για να δημιουργήσετε μια επιφάνεια απόκρισης και να αναλύσετε τις αλληλεπιδράσεις μεταξύ των παραμέτρων. Κάτω από πολλές συνθήκες λειτουργίας, μια μεμονωμένη παράμετρος μπορεί να παραμείνει εντός του κατάλληλου εύρους, ενώ ο συνδυασμός δύο παραμέτρων μπορεί να οδηγήσει σε διείσδυση πρωτεΐνης. Τέτοια φαινόμενα αλληλεπίδρασης δεν μπορούν να εντοπιστούν μέσω παραδοσιακών πειραμάτων-παράγοντα-σε-α-μια στιγμή. Με βάση το μοντέλο, ορίστε έναν λειτουργικό χώρο σχεδιασμού. Εφόσον οι παράμετροι της διαδικασίας παραμένουν εντός αυτού του εύρους, μπορεί να διασφαλιστεί η αποτελεσματική κατακράτηση πρωτεΐνης ενώ οι ακαθαρσίες απομακρύνονται με διαδιήθηση.
3. Πρόκληση χειρότερης-περίπτωσης (απαιτείται για τον χαρακτηρισμό της διαδικασίας)
Επιλέξτε παραμέτρους διεργασίας στα άκρα των ορίων λειτουργίας για να προσομοιώσετε τη μεταβλητότητα παραγωγής: μέγιστη TMP, ελάχιστος ρυθμός διασταυρούμενης ροής και ανώτερη-οριακή συγκέντρωση πρωτεΐνης. Βεβαιωθείτε ότι ακόμη και κάτω από ακραίες συνθήκες λειτουργίας,-δεν λαμβάνει χώρα απώλεια πρωτεΐνης στόχου μεγάλης κλίμακας, με αποτέλεσμα να πληρούνται οι απαιτήσεις ελέγχου CMC.
IV. Πολλαπλές αναλυτικές μέθοδοι για τον εντοπισμό πρωτεϊνών που ανιχνεύονται στο διήθημα και για τη διάκριση του στόχου mAb, των θραυσμάτων αποικοδόμησης και του HCP
Με βάση την αναλυτική αποτελεσματικότητα, το κόστος και τα σενάρια υποβολής κανονιστικών ρυθμίσεων, οι μέθοδοι μπορούν να χωριστούν σε δύο κατηγορίες: ταχεία διαλογή και επιβεβαιωτική δοκιμή. Οι ταχείες μέθοδοι θα πρέπει να έχουν προτεραιότητα για την παρακολούθηση της διαδικασίας ρουτίνας. όταν εμφανίζονται μη φυσιολογικές αποκλίσεις, θα πρέπει να χρησιμοποιούνται ακριβείς μέθοδοι αναγνώρισης.
1. Φασματοφωτομετρία υπεριώδους ακτινοβολίας (ταχύς διαδικτυακός έλεγχος, προτιμάται για συνήθη παρακολούθηση δαπέδου καταστήματος-)
Συλλέξτε το διήθημα και μετρήστε την απορρόφησή του Α280. Αυτό μπορεί να καθορίσει μόνο εάν η πρωτεΐνη υπάρχει στο διήθημα και δεν μπορεί να διακρίνει το είδος της πρωτεΐνης. Χρησιμοποιείται κυρίως για την παρακολούθηση της διαδικασίας ρουτίνας. Μια συνεχώς αυξανόμενη τιμή Α280 υποδεικνύει επιδείνωση της διαρροής πρωτεΐνης και απαιτεί άμεση αναστολή της διαδιήθησης και διερεύνηση της διαδικασίας.
2. SDS-Ηλεκτροφόρηση PAGE (η πιο συχνά χρησιμοποιούμενη μέθοδος ποιοτικής αναγνώρισης)
Χρησιμοποιήστε μειωτική και μη{0}}ηλεκτροφόρηση και συγκρίνετε τις θέσεις της ζώνης με αυτές του mAb στόχου στην πρώτη ύλη:
1) Εάν η θέση της ζώνης είναι απολύτως συνεπής με το στοχευόμενο mAb, άθικτο mAb έχει διαποτίσει τη μεμβράνη.
2) Εάν εμφανιστούν ζώνες μικρότερου-μοριακού- βάρους, η πρωτεΐνη έχει υποστεί υδρολυτική διάσπαση, δημιουργώντας θραύσματα mAb.
3) Εάν οι ζώνες είναι διάσπαρτες με πολλαπλές διάφορες ζώνες, οι περισσότερες είναι πρωτεΐνες κυττάρου ξενιστή (HCPs) από κύτταρα ξενιστές E. coli/CHO και όχι το προϊόν στόχο.
3. Χρωματογραφία αποκλεισμού-μεγέθους απόδοσης- (HPSEC)
Διαχωρίστε τα συστατικά σύμφωνα με το μοριακό μέγεθος και συγκρίνετε τους χρόνους έκλουσής τους με αυτούς του χρωματογράμματος πρώτης ύλης:
- Μια κύρια κορυφή με τον ίδιο χρόνο κατακράτησης με το mAb υποδηλώνει ανέπαφη πρωτεΐνη-στόχο.
- Μια κορυφή που εκλούεται νωρίτερα υποδηλώνει-μοριακά-συσσωματώματα/θραύσματα υψηλού βάρους.
- Μια κορυφή που εκλούεται αργότερα υποδεικνύει θραύσματα αποικοδόμησης χαμηλού-μοριακού-βάρους.
- Η απουσία μιας χαρακτηριστικής κύριας κορυφής υποδηλώνει πρωτεΐνες ακαθαρσίας HCP.
Αυτή η μέθοδος μπορεί να παρέχει ποσοτικά δεδομένα και μπορεί να συμπεριληφθεί σε εκθέσεις διερεύνησης απόκλισης διαδικασίας. έχει υψηλή αποδοχή σε υλικά κλινικής υποβολής.
4. Δοκιμή κιτ ELISA πρωτεΐνης ξενιστή HCP-
Εάν ανιχνευθεί πρωτεΐνη στο διήθημα, το αποτέλεσμα ELISA είναι αυξημένο και το HPSEC δεν δείχνει χαρακτηριστική κορυφή mAb, το υλικό που διαρρέει μπορεί βασικά να προσδιοριστεί ότι είναι πρωτεΐνες κυττάρων ξενιστών CHO-. Αυτό υποδηλώνει ατελή απομάκρυνση ακαθαρσιών κατά τον ανάντη καθαρισμό. οι ακαθαρσίες ξεπλένονται κατά το στάδιο UF/DF και δεν αντιπροσωπεύουν απώλεια προϊόντος.
5. Επαλήθευση χρωματογραφίας συγγένειας (χρωματογραφία πρωτεΐνης Α)
Η πρωτεΐνη Α δεσμεύει ειδικά την περιοχή Fc των mAbs. Φορτώστε το δείγμα διήθησης στη στήλη: η εμφάνιση μιας χαρακτηριστικής κορυφής έκλουσης υποδηλώνει την παρουσία άθικτου αντισώματος στόχου. Η απουσία κορυφής έκλουσης αποδεικνύει ότι οι πρωτεΐνες στο διήθημα είναι όλες πρωτεΐνες πρόσμιξης.
6. Φασματομετρία μάζας (LC-MS) (σε-ιχνηλασιμότητα σε βάθος· χρησιμοποιείται για τη διερεύνηση μεγάλων αποκλίσεων διεργασιών)
Το LC-MS μπορεί να αναλύσει απευθείας την αλληλουχία αμινοξέων και να προσδιορίσει με ακρίβεια την προέλευση της πρωτεΐνης. Χρησιμοποιείται κυρίως για τη διερεύνηση δύσκολων ή ασυνήθιστων αποκλίσεων και δεν χρησιμοποιείται ως ρουτίνα σε-δοκιμές ελέγχου διαδικασίας.
V. Διορθωτικές ενέργειες που αντιστοιχούν σε διαφορετικά αναλυτικά αποτελέσματα
1. Ανιχνεύθηκε ανέπαφο mAb στόχος στο διήθημα
Μειώστε την διαμεμβρανική πίεση και την τελική συγκέντρωση μετά τη συμπύκνωση. Περιορίστε το εύρος λειτουργίας της διαδικασίας με βάση τα αποτελέσματα DOE. και ελέγξτε την ακεραιότητα της κασέτας μεμβράνης.
2. Θραύσματα αποικοδόμησης αντισώματος που ανιχνεύθηκαν στο διήθημα
Διερεύνηση διατμητικής τάσης σε όλη τη διαδικασία και ακραίων pH. βελτιστοποιήστε το ανοδικό βήμα απενεργοποίησης του ιού για να μειώσετε τη διάσπαση πρωτεΐνης.
3. Μόνο πρωτεΐνες πρόσμειξης HCP που ανιχνεύονται στο διήθημα
Δεν απαιτείται προσαρμογή των παραμέτρων UF/DF. Ανιχνεύστε το πρόβλημα στα προηγούμενα βήματα χρωματογραφίας και βελτιώστε την αφαίρεση ακαθαρσιών κατά τη διάρκεια της χρωματογραφίας συνάφειας και ανταλλαγής ιόντων-.
VI. Περίληψη
Για να αποτραπεί η διαρροή πρωτεΐνης κατά τη διάρκεια της UF/DF, ο παραδοσιακός έλεγχος διεργασίας βασίζεται στην ιστορική εμπειρία για τον καθορισμό μεμονωμένων παραμέτρων σημείου, οι οποίες μπορούν να αντιμετωπίσουν επαρκώς μόνο τη σταθερή παραγωγή μικρής- κλίμακας. Για να διασφαλιστεί η σταθερή απόδοση κατά τη σταδιακή κλίμακα της διαδικασίας-επάνω, θα πρέπει να χρησιμοποιείται ο χαρακτηρισμός διεργασίας βάσει DOE- για τη δημιουργία ενός χώρου σχεδιασμού διεργασιών με επαρκή ανοχή. Ο έλεγχος παραμέτρων βάσει διαστήματος-μπορεί να αντισταθμίσει τη μεταβλητότητα παραγωγής. Μόλις ανιχνευτεί πρωτεΐνη στο διήθημα, ένα απλό σύστημα ανίχνευσης υπεριώδους ακτινοβολίας μπορεί να παρέχει μια αρχική προειδοποίηση, ακολουθούμενη από ηλεκτροφόρηση, HPSEC και ELISA για ιχνηλασιμότητα και αναγνώριση. Αυτό επιτρέπει την ακριβή διαφοροποίηση μεταξύ του προϊόντος-στόχου και των ακαθαρσιών κυττάρου-κεντρικού υπολογιστή, επιτρέποντας τη στοχευμένη διερεύνηση αιτιών-και τις διορθωτικές ενέργειες. Αυτό είναι επίσης ένα τυποποιημένο ερευνητικό στοιχείο που περιλαμβάνεται επί του παρόντος στην τεκμηρίωση CMC για έργα mAb.
