Προφυλάξεις για τη χρήση σωλήνα υπερδιήθησης
(1) Επιλέξτε τον κατάλληλο σωλήνα υπερδιήθησης. Γενικά, το μοριακό βάρος που πρέπει να διατηρείται δεν πρέπει να υπερβαίνει το 1/3 του μοριακού βάρους της πρωτεΐνης-στόχου. Για παράδειγμα, εάν το μοριακό βάρος της πρωτεΐνης-στόχου είναι 35kDa, μπορεί να επιλεγεί ο σωλήνας υπερδιήθησης με μοριακό βάρος 10kDa. Εάν το μοριακό βάρος της πρωτεΐνης-στόχου είναι περίπου 10kd, μπορεί να χρησιμοποιηθεί ένας σωλήνας υπερδιήθησης με μοριακό βάρος 3KD. Διαβάστε προσεκτικά το εγχειρίδιο οδηγιών και δώστε προσοχή στη διαφορετική ανοχή της μεμβράνης υπερδιήθησης σε διάφορες χημικές ουσίες.
(2) Η πρόσφατα αγορασμένα υπερδιήθηση είναι ξηρή. Προσθέστε εξαιρετικά νερό πριν από τη χρήση και το νερό θα περάσει εντελώς μέσα από τη μεμβράνη. Προψύξτε το σε ένα λουτρό πάγου ή ψυγείο για λίγα λεπτά. Στη συνέχεια, ρίξτε το νερό και προσθέστε το διάλυμα πρωτεΐνης. Η προστιθέμενη ποσότητα δεν πρέπει να υπερβαίνει τη λευκή γραμμή στην κορυφή του σωλήνα. Η εγχείρηση πρέπει να είναι ελαφριά. Πριν από την προσθήκη πρωτεϊνικού διαλύματος, ο σωλήνας υπερδιήθησης πρέπει να εισαχθεί στον πάγο για προψύξη.
(3) Υπόλοιπο. Τόσο η μάζα όσο και το κέντρο βάρους πρέπει να είναι ισορροπημένα. Σημειώστε ότι η ταχύτητα και η επιτάχυνση δεν πρέπει να είναι πολύ γρήγορες, διαφορετικά η μεμβράνη υπερδιήθησης θα υποστεί άμεση βλάβη. Ξεκινήστε φυγοκεντρική υπερδιήθηση (προψύξη φυγοκέντρησης στους 4 βαθμούς). Μετά τη μετατροπή των RPM διαφορετικών φυγοκεντρητών σε G, είναι διαφορετικό. Ρυθμίστε την επιτάχυνση της φυγοκέντρησης στο χαμηλότερο γρανάζι για να μειώσετε την πίεση στη μεμβράνη. Σημειώστε ότι πρέπει να περιμένετε μέχρι η φυγόκεντρος να φτάσει την ταχύτητα-στόχο πριν φύγετε από τη φυγόκεντρο, διαφορετικά όταν υπάρχει πρόβλημα με τη φυγόκεντρο, δεν μπορείτε να το αντιμετωπίσετε την πρώτη φορά. Η κατεύθυνση της μεμβράνης και του περιστρεφόμενου άξονα ρυθμίζεται σύμφωνα με τις οδηγίες (στην περίπτωση της γωνίας περιστροφής φυγοκέντρησης, η μεμβράνη είναι κάθετη προς τον άξονα). Στην πρακτική χρήση, η ταχύτητα είναι γενικά χαμηλότερη από εκείνη στο εγχειρίδιο, η οποία μπορεί να παρατείνει τη διάρκεια ζωής του φυγοκεντρικού σωλήνα.
(4) Όταν συγκεντρώνεται στα υπόλοιπα 1ml, πάρτε το διάλυμα ρυθμιστικού διαλύματος 50ul και προσθέστε 10ul για να ρέει για να δείτε αν γίνεται μπλε, έτσι ώστε να κρίνετε εάν ο σωλήνας υπερδιήθησης διαρρέει πρωτεΐνη. Εάν ο σωλήνας διαρρεύσει, ρίξτε το ανώτερο στρώμα και ρέετε μέσα από το νέο σωλήνα και ξεκινήστε την υπερδιήθηση. Για να κρίνετε με ακρίβεια εάν ο σωλήνας διαρρέει, φυγοκεντρήστε με 5mgml BSA για 10 λεπτά, στη συνέχεια πάρτε τη ροή, εκτελέστε την κόλλα πρωτεΐνης ή bradford για τραχιά μέτρηση και συνεχίστε να προσθέτετε το υπόλοιπο πρωτεϊνικό διάλυμα για συγκέντρωση (λειτουργήστε στον πάγο για να αποτρέψετε τη θέρμανση της πρωτεΐνης) μέχρι να προστεθούν όλα τα συμπυκνωμένα διαλύματα. Δώστε προσοχή στο αν η καθίζηση πρωτεϊνών συμβαίνει κατά τη διάρκεια της φυγοτερίκευσης, με αποτέλεσμα την απόφραξη των σωλήνων. Εάν συμβεί καθίζηση, προσδιορίστε τη συγκεκριμένη αιτία υετού, εάν η συγκέντρωση πρωτεϊνών είναι πολύ υψηλή ή το ρυθμιστικό διάλυμα είναι ακατάλληλο. Το πρώτο μπορεί να επιλυθεί με ταυτόχρονη υπερδιήθηση με πολλαπλούς σωλήνες υπερδιήθησης για τη μείωση της συγκέντρωσης. Το τελευταίο είναι να αλλάξετε διαφορετικά ρυθμιστικά διαλύματα μέχρι η πρωτεΐνη να μην κατακρημνίζεται.
(5) Τα προηγούμενα βήματα χρησιμοποιούνται για τη συγκέντρωση πρωτεϊνών. Εάν θέλετε να αλλάξετε το ρυθμιστικό διάλυμα, όταν το συνολικό πρωτεϊνικό διάλυμα συγκεντρώνεται σε περίπου 1ml, προσθέστε απαλά ένα νέο ρυθμιστικό διάλυμα (υπερδιήθηση μέσω μεμβράνης υπερδιήθησης 0,22um) και στη συνέχεια συγκεντρωθείτε σε περίπου 1ml για τρεις συνεχόμενες φορές. Ο τελικός όγκος της τελευταίας συγκέντρωσης εξαρτάται από την απαιτούμενη συγκέντρωση πρωτεϊνών, η οποία γενικά δεν υπερβαίνει τα 500ul, ή μπορεί να συγκεντρωθεί σε λιγότερο από 200ul. Σύμφωνα με τη συγκέντρωση όγκου τουλάχιστον 10 φορές κάθε φορά, μπορεί να φτάσει περισσότερες από 1000 φορές τρεις φορές, γεγονός που μπορεί βασικά να επιτύχει το σκοπό της αλλαγής του ρυθμιστικού διαλύματος.
