Μελέτη για την εφαρμογή της βαθιάς διήθησης στη διαδικασία παραγωγής του εμβολίου κατά του αφθώδους πυρετού
Πρόλογος - Τι είναι η νόσος του αφθώδους στόματος
Τον 14ο αιώνα υπάρχουν γραπτά αρχεία για παρόμοια αφθώδη πυρετό στην Ευρώπη. Ο αφθώδης πυρετός είναι μια οξεία, εμπύρετη, εξαιρετικά μεταδοτική ασθένεια που προκαλείται από τον ιό του αφθώδους πυρετού.
Τα κλινικά συμπτώματα των ενήλικων ζώων περιλαμβάνουν: αυξημένη θερμοκρασία σώματος, φουσκάλες και έλκος στο στόμα, φουσκάλες και έλκος στην οπλή, ακόμη και αποβολή του κελύφους της οπλής, πρόκληση δυσκολίας στο φαγητό και τον ύπνο, απώλεια βάρους και ακόμη και απώλεια οικονομικής αξίας στα οικονομικά ζώα ;
Τα κλινικά συμπτώματα των νεαρών ζώων περιλαμβάνουν: αυξημένη θερμοκρασία σώματος, μυοκαρδίτιδα και άλλα συμπτώματα, μόλις εμφανιστούν, τα νεαρά ζώα έχουν υψηλή θνησιμότητα.
Περίληψη
Τα τελευταία 500 χρόνια, ο αφθώδης πυρετός έχει ξεσπάσει επανειλημμένα σε όλο τον κόσμο και ένας μεγάλος αριθμός χοίρων, βοοειδών, προβάτων και άλλων κατοικίδιων ζώων και άγριων οπληφόρων έχουν πεθάνει ή αρρωστήσει, επηρεάζοντας σοβαρά τα ζώα και τη βιομηχανία εκτροφής.
Προκειμένου να μελετηθεί η εφαρμογή της τεχνολογίας βαθιάς διήθησης στη διαδικασία παραγωγής του εμβολίου κατά του αφθώδους πυρετού, δοκιμάστηκε και συγκρίθηκε η απόδοση φιλτραρίσματος της επιφανειακής διήθησης και της βαθιάς διήθησης, καθώς και η προστατευτική επίδραση στη βακτηριοκτόνο διήθηση. Μελετήθηκαν τα πλεονεκτήματα της βαθιάς διήθησης υψηλού φορτίου στην απομάκρυνση των κυτταρικών υπολειμμάτων. Αναλύθηκαν τα αντίστοιχα σχήματα διήθησης για μέσο κυτταροκαλλιέργειας με διαφορετική θολότητα.
Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι το φορτίο βαθιάς διήθησης ήταν 13,9 φορές μεγαλύτερο από αυτό της επιφανειακής διήθησης, η θολότητα του υγρού του φίλτρου ήταν μόνο το 23,5% της επιφανειακής διήθησης και το επακόλουθο φορτίο αποβακτηριδίωσης 0.2um ήταν 7,2 φορές μεγαλύτερο από το επιφανειακό φιλτράρισμα. Με τη χρήση του ειδικού προσδέματος ρητίνης, η θολότητα του υγρού φίλτρου είναι 38,6% αυτής του συνηθισμένου βαθύ φίλτρου με το ίδιο μέγεθος πόρων, το οποίο είναι ευεργετικό για την προστασία της κατάντη διαδικασίας. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι η βαθιά διήθηση, ιδιαίτερα η βαθιά διήθηση με ισχυρό θετικό φορτίο, θα μπορούσε να εφαρμοστεί αποτελεσματικά στην παραγωγή εμβολίου αφθώδους πυρετού και θα πρέπει να καθιερωθούν κατάλληλες διαδικασίες διήθησης για διαφορετικά μέσα καλλιέργειας.
Αφθώδης πυρετός και βαθιά διήθηση
Ο αφθώδης πυρετός (FMD) είναι μια οξεία, εμπύρετη και μεταδοτική νόσος των δίχηλων ζώων που προκαλείται από τον ιό του αφθώδους πυρετού (FMDV). Τα ζώα που είναι πιο ευαίσθητα σε αυτή την ασθένεια περιλαμβάνουν βοοειδή, χοίρους και πρόβατα. Ο αφθώδης πυρετός είναι ενδημικός στην Ασία, την Αφρική, τη Μέση Ανατολή και τη Νότια Αμερική, με πολύ υψηλή επίπτωση και ταχεία μετάδοση. Ο Παγκόσμιος Οργανισμός για την Υγεία των Ζώων (OIE) την κατατάσσει ως την πρώτη ζωονόσος κατηγορίας Α, απαιτώντας από τα κράτη μέλη να συμπεριλάβουν τον αφθώδη πυρετό στον κατάλογο των γνωστοποιούμενων ζωονόσων. Ο εμβολιασμός είναι ένα αποτελεσματικό μέσο ειδικής πρόληψης του αφθώδους πυρετού. Σημαντικό ρόλο στην πρόληψη και τον έλεγχο του αφθώδους πυρετού διαδραματίζει το αδρανοποιημένο εμβόλιο αφθώδους πυρετού, το οποίο παρασκευάζεται με την απενεργοποίηση του ανέπαφου ιού με απενεργοποιητή.
Η αντιγονικότητα του ίδιου του FMDV είναι φτωχή και η απενεργοποίηση του ιού έχει μεγάλη επίδραση στο αντιγόνο του. Επομένως, στην τρέχουσα παραγωγή εμβολίου κατά του αφθώδους πυρετού, το εμβόλιο υψηλής καθαρότητας κατά του αφθώδους πυρετού μπορεί να εξασφαλίσει την περιεκτικότητα σε αντιγόνο και την καθαρότητα της μοναδιαίας δόσης, κάτι που είναι ιδιαίτερα σημαντικό και είναι επίσης η τρέχουσα στρατηγική εμβολιασμού. Αυτό θέτει υψηλές απαιτήσεις για τον καθαρισμό των ιών κατάντη. Επιπλέον, πριν από το 2009, τα ανενεργά εμβόλια κατά του αφθώδους πυρετού στην Κίνα υιοθέτησαν ως επί το πλείστον τη μέθοδο καλλιέργειας της περιστρεφόμενης φιάλης και της προσκόλλησης στον τοίχο. Με την αυξανόμενη ζήτηση για εμβόλια, προέκυψαν σταδιακά τα μειονεκτήματα αυτής της μεθόδου καλλιέργειας που απαιτούσε μεγάλο αριθμό περιστρεφόμενων φιαλών, χαμηλή απόδοση και χαμηλό επίπεδο έκφρασης.
Ως εκ τούτου, τα τελευταία χρόνια, η τεχνολογία κυτταροκαλλιέργειας έχει αλλάξει αργά από την προηγούμενη προσκολλημένη καλλιέργεια σε καλλιέργεια εναιωρήματος και η παραγωγή του ιού έχει βελτιωθεί σημαντικά. Ωστόσο, με την αύξηση της παραγωγής του ιού, η αλλαγή του τρόπου καλλιέργειας έχει επιφέρει μεγαλύτερη πίεση στον κατάντη καθαρισμό, επειδή αντίστοιχα αυξήθηκαν τα κυτταρικά υπολείμματα που δημιουργούνται από τη διαδικασία καλλιέργειας, η απελευθέρωση των πρωτεϊνών ξενιστή, το DNA του ξενιστή κ.λπ. θέτει περαιτέρω απαιτήσεις για την ικανότητα καθαρισμού κατάντη.
Η τεχνολογία φιλτραρίσματος μεμβράνης χρησιμοποιείται ευρέως στη διαδικασία παραγωγής βιολογικών προϊόντων όπως τα εμβόλια, μεταξύ των οποίων η τεχνολογία διήθησης συνεχούς ρεύματος χρησιμοποιείται συνήθως στη διαδικασία συλλογής δηλητηρίου ασθενειών για τον διαχωρισμό αδιάλυτων ακαθαρσιών όπως τα κυτταρικά υπολείμματα. Στην πρώιμη διευκρίνιση FMDV, υιοθετήθηκε κυρίως η τεχνολογία επιφανειακής διήθησης που αντιπροσωπεύεται από το στοιχείο φίλτρου με πτυσσόμενη μεμβράνη. Με την αλλαγή των συνθηκών καλλιέργειας, την αύξηση των ακαθαρσιών κυτταρικών υπολειμμάτων, η επιφανειακή διήθηση είναι δύσκολο να επιτευχθεί το αποτέλεσμα διαύγασης και επειδή το φορτίο επιφανειακής διήθησης είναι χαμηλό, το κόστος των υλικών φίλτρου γίνεται όλο και υψηλότερο.
Κάτω από το παραπάνω υπόβαθρο, η βαθιά διήθηση εφαρμόζεται ολοένα και περισσότερο στη διαδικασία κυτταρικού διαχωρισμού του FMDV. Το βαθύ υλικό φίλτρου αποτελείται συνήθως από μακριές και λεπτές ίνες από φυσικές πηγές και το κανάλι που σχηματίζεται από το μέσο φίλτρου μετά το σχηματισμό μιας μεμβράνης είναι συχνά πολύ ελικοειδής, παρόμοιο με τη δομή του ανοίγματος του λαβυρίνθου. Τα σωματίδια ακαθαρσίας παγιδεύονται συχνά μέσα στο φίλτρο και όχι στην επιφάνεια. Επιπλέον, το τοίχωμα του καναλιού φίλτρου συχνά απορροφά ένα μέρος εξαιρετικά λεπτών ακαθαρσιών σωματιδίων με ηλεκτροστατική δράση ή διαμοριακή δύναμη. Γενικά, ο μηχανισμός διήθησης της βαθιάς διήθησης χαρακτηρίζεται από μηχανική συγκράτηση και προσρόφηση.
Μέθοδος φιλτραρίσματος σταθερού ρεύματος
Τοποθετήστε την πλάκα βαθέως φίλτρου στη συσκευή φίλτρου σταθερού ρεύματος, πλύνετε την πλάκα φίλτρου με ρυθμιστικό διάλυμα PBS άνω των 54 L/m2. Αφού ολοκληρωθεί το πλύσιμο, ξεκινήστε την περισταλτική αντλία για να αντλεί αργά το υγρό, ρυθμίστε αργά την ταχύτητα της αντλίας περίπου στον αναμενόμενο ρυθμό ροής και φιλτράρετε το υγρό. Καταγράψτε τον όγκο διήθησης, το χρόνο, τη διαφορά πίεσης και τη θολότητα κατά τη διάρκεια της διαδικασίας φιλτραρίσματος. Το διήθημα συλλέχθηκε για ανίχνευση αντιγόνου.
Πλεονεκτήματα της βαθιάς διήθησης
Το επιφανειακό φιλτράρισμα είναι μια τεχνολογία που συλλαμβάνει σωματίδια στην επιφάνεια του υλικού φίλτρου για να επιτευχθεί φιλτράρισμα. Ο μηχανισμός φιλτραρίσματος βασίζεται κυρίως στο μέγεθος των σωματιδίων στο ρευστό κόσκινο, μεγάλα σωματίδια παγιδεύονται στην επιφάνεια της μεμβράνης του φίλτρου. Το βαθύ φιλτράρισμα χρησιμοποιεί εσωτερικά κανάλια για αναχαίτιση και προσρόφηση σωματιδίων σε βάθος. Το διάγραμμα σύγκρισης των δύο φαίνεται στο σχήμα 1.
Το αδρανοποιημένο διάλυμα εμβολίου κατά του αφθώδους πυρετού από έναν συγκεκριμένο κατασκευαστή προδιηθήθηκε με επιφανειακή μεμβράνη πολυπροπυλενίου και πλάκα βαθιάς φίλτρου 0.45um αντίστοιχα και στη συνέχεια διηθήθηκε με βακτηριοκτόνο φίλτρο 0.2um. Τα δεδομένα φιλτραρίσματος φαίνονται στον Πίνακα 1.
Η θολότητα του αδρανοποιημένου διαλύματος εμβολίου κατά του αφθώδους πυρετού είναι 77 NTU. Εάν τα βακτήρια φιλτράρονται απευθείας, ένας μεγάλος αριθμός κυτταρικών θραυσμάτων θα προκαλέσει αναπόφευκτα την ταχεία απόφραξη της μεμβράνης του φίλτρου 0.2um, γεγονός που θα επηρεάσει τη μετάδοση των σωματιδίων 146S. Ως εκ τούτου, η προ-διήθηση σχεδιάστηκε πριν από τη διήθηση αποβακτηριδίωσης και συγκρίθηκαν οι δύο μέθοδοι προ-διήθησης της βαθιάς διήθησης και της επιφανειακής διήθησης. Η πλάκα βάθους φίλτρου διπλής στρώσης επιλέγεται για διήθηση, το φορτίο είναι 641 L/m2 και το βαθύ φίλτρο μειώνει το υλικό των 77 NTU σε 9,65 NTU, το οποίο είναι καθαρό και φωτεινό. Το φορτίο επιφανειακής διήθησης των 0.45um είναι μόνο 46 L/m2 και η θολότητα του υγρού του φίλτρου είναι τόσο υψηλή όσο 41 NTU, κάτι που δεν είναι κατάλληλο για προδιήθηση. Σύμφωνα με τη σύγκριση του επόμενου φορτίου διήθησης 0,2 um, το φορτίο αποβακτηριδιακής μεμβράνης διήθησης μετά από βαθιά διήθηση είναι 655 L/m2, το οποίο είναι 7,2 φορές το αντίστοιχο φορτίο διήθησης επιφανειακής διήθησης (μόνο 91 L/m2) .
Τα αποτελέσματα της δοκιμής 146S δείχνουν ότι η απόδοση του συστήματος βαθιάς διήθησης είναι υψηλότερη από εκείνη του συστήματος επιφανειακής διήθησης. Το φορτίο βαθιάς διήθησης ήταν 13,9 φορές μεγαλύτερο από αυτό της επιφανειακής διήθησης, η θολότητα του υγρού του φίλτρου ήταν μόνο 23,5% εκείνης της επιφανειακής διήθησης και το επακόλουθο φορτίο διήθησης 0.2um ήταν 7,2 φορές μεγαλύτερο από αυτό του επιφανειακό φιλτράρισμα. Επομένως, τόσο από την άποψη του κόστους όσο και από την άποψη της απόδοσης, το σύστημα βαθιάς διήθησης είναι σημαντικά καλύτερο από το σύστημα φιλτραρίσματος με επιφανειακή μεμβράνη.
Πλεονεκτήματα του βαθιού φίλτρου ισχυρού θετικού φορτίου
Η πλάκα βαθιάς φίλτρου θετικού φορτίου και η πλάκα φίλτρου με ισχυρό θετικό φορτίο χρησιμοποιήθηκαν για να συγκριθεί το αδρανοποιημένο διάλυμα του εμβολίου κατά του αφθώδους πυρετού από διαφορετικές πηγές. Τα αποτελέσματα της δυνατότητας φιλτραρίσματος φαίνονται στον Πίνακα 2 και η αλλαγή της ταχύτητας φιλτραρίσματος και της διαφοράς πίεσης στη διαδικασία φιλτραρίσματος φαίνεται στη διάταξη χρώματος 2.
Οι δύο ομάδες πλακών βαθιάς φίλτρου που χρησιμοποιούνται έχουν την ίδια ακρίβεια ανοίγματος και η απόδοση είναι πολύ συνεπής από την άποψη της αλλαγής του φορτίου και της διαφοράς πίεσης και η καμπύλη αλλαγής διαφοράς πίεσης στο Σχήμα 2 είναι βασικά πανομοιότυπη.
Ωστόσο από τη θολότητα του υγρού του φίλτρου η διαφορά είναι πολύ μεγάλη. Το υγρό φίλτρου της συνηθισμένης θετικά φορτισμένης πλάκας φίλτρου διπλής στρώσης είναι 25 NTU, ενώ το υγρό φίλτρου της ισχυρά θετικά φορτισμένης πλάκας φίλτρου βαθιάς στρώσης με το ίδιο άνοιγμα είναι μόνο 9,65 NTU, που είναι μόνο το 38,6% της συνηθισμένης πλάκας βαθέως φίλτρου. Αυτό οφείλεται κυρίως στο ειδικό πρόσδεμα ρητίνης στο υλικό φίλτρου πλάκας φίλτρου με ισχυρό θετικό φορτίο. Η θολότητα μειώνεται σε λιγότερο από 10NTU από την ισχυρά θετική πλάκα φίλτρου διπλής στιβάδας και τα κυτταρικά θραύσματα απορροφώνται πλήρως ή παγιδεύονται, γεγονός που ευνοεί την επακόλουθη διαδικασία υπερδιήθησης ή βακτηριοκτόνου φιλτραρίσματος. Εκτός από την επίδραση προσρόφησης στα αδιάλυτα κυτταρικά υπολείμματα, οι Yigzaw Y et al ανέφεραν επίσης την επίδραση απομάκρυνσης της ισχυρά θετικά φορτισμένης βαθιάς πλάκας φίλτρου στην πρωτεΐνη του ξενιστή κυττάρου και οι Dorsey N et al ανέφεραν την επίδραση απομάκρυνσης της πλάκας βαθιάς φίλτρου ισχυρά θετικά φορτισμένης στο DNA.
Καθιέρωση διαδικασίας διαύγασης διήθησης για το υπερκείμενο του εμβολίου κατά του αφθώδους πυρετού με βαθιά διήθηση
Μέσω της παραπάνω συγκριτικής μελέτης της επιφανειακής διήθησης και της βαθιάς διήθησης και της μελέτης της επίδρασης διαύγασης της ειδικής πλάκας φίλτρου με ισχυρό θετικό φορτίο, διαφορετικά σχήματα διήθησης θα πρέπει να αντιστοιχιστούν με το αδρανοποιημένο υπερκείμενο του εμβολίου κατά του αφθώδους πυρετού που παράγεται με διαφορετικά συνθήκες πολιτισμού. Για φυγόκεντρο υπερκείμενο υγρό με 3 διαφορετική θολότητα, χαμηλή θολότητα, μέση θολότητα και υψηλή θολότητα, το σχήμα βαθιάς διήθησης και οι αντίστοιχες παράμετροι διήθησης φαίνονται στον Πίνακα 3.
Για το φυγοκεντρικό υπερκείμενο υγρό με χαμηλή θολότητα, η πλάκα βαθιάς φίλτρου μονής στρώσης μπορεί αποτελεσματικά να διαυγάσει και να αφαιρέσει μια μικρή ποσότητα κυτταρικών υπολειμμάτων. Για το φυγοκεντρικό υπερκείμενο μεσαίας θολότητας, η πλάκα βάθους φίλτρου διπλής στρώσης μπορεί να διαυγάσει αποτελεσματικά, ειδικά η πλάκα φίλτρου με ισχυρό θετικό φορτίο μπορεί να μειώσει τη θολότητα σε λιγότερο από 5 NTU. Για φυγόκεντρο υπερκείμενο υγρό με υψηλότερη θολότητα, η συνδυασμένη πλάκα φίλτρου μπορεί να διαυγαστεί αποτελεσματικά. Ανεξάρτητα από τη διαδικασία, η ικανότητα επεξεργασίας είναι 500 ~ 800 L/m2, η θολότητα του υγρού του φίλτρου είναι μικρότερη από 20 NTU και το αντιγόνο στόχος ανακτάται πλήρως, κατάλληλο για παραγωγή μεγάλης κλίμακας.
Συζήτηση
Στη δεκαετία του 1970, τα μέσα φίλτρου καθορίστηκαν να μην χρησιμοποιούν υλικά αμιάντου, λόγω της παρουσίας καρκινογόνων ουσιών στα υλικά αμιάντου. Το υλικό του βαθέως φίλτρου δεν περιέχει αμίαντο και έχει ισχυρότερο θετικό φορτίο. Το υλικό του φίλτρου είναι κατασκευασμένο από μήτρα ινών ξύλου και βοήθημα φίλτρου. Στη διαδικασία παραγωγής, η πολυμερής ρητίνη χρησιμοποιείται για τη σύνδεση των βασικών εξαρτημάτων και οι λειτουργικές ομάδες θετικού φορτίου σε αυτήν δίνουν αποτελεσματικά την ικανότητα προσρόφησης φορτίου του υλικού βαθιάς φίλτρου. Η εξαιρετική απόδοση της προσροφητικής βαθιάς διήθησης στην ικανότητα σύλληψης λεπτών σωματιδίων φαίνεται στο Σχήμα 3.
Σε αυτό το πείραμα, επιλέχθηκαν διαφορετικά συστατικά ρητίνης και διαφορετικά υλικά βαθιάς φίλτρου ακριβείας για την αποσαφήνιση της δοκιμής διήθησης του διαλύματος καλλιέργειας FMDV και η δοκιμή σύγκρισης πραγματοποιήθηκε με επιφανειακή διήθηση. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι η βαθιά διήθηση ήταν πιο κατάλληλη για την απομάκρυνση των κυτταρικών υπολειμμάτων από την επιφανειακή διήθηση, η οποία ήταν ευνοϊκή για την επακόλουθη μονάδα διήθησης ελέγχου μικροβιακού φορτίου (0.2um). Επιπλέον, συγκρίνοντας το αποτέλεσμα φιλτραρίσματος της πλάκας φίλτρου ισχυρού θετικού φορτίου και της πλάκας φίλτρου κανονικού θετικού φορτίου, η πλάκα φίλτρου ισχυρού θετικού φορτίου δείχνει μια ισχυρή ικανότητα ελέγχου θολότητας, η οποία μπορεί να μειώσει τη θολότητα σε λιγότερο από 5 NTU, η οποία είναι πολύ ευνοϊκό για τη βελτίωση της στιβαρότητας ολόκληρης της διαδικασίας φιλτραρίσματος.
Η ανάντη διαδικασία καλλιέργειας έχει μεγάλη επίδραση στα στάδια συγκομιδής των δραστικών συστατικών. Μέσω δοκιμών, αυτό το πείραμα δημιούργησε τελικά ένα επεκτάσιμο σχήμα διήθησης για μέσα κυτταροκαλλιέργειας με διαφορετική θολότητα, το οποίο έχει κάποια καθοδηγητική σημασία για παραγωγή μεγάλης κλίμακας.
Το φίλτρο βάθους που θα λανσαριστεί από την Guidling Technology είναι ένα στοιχείο φίλτρου τύπου δίσκου, το οποίο είναι ένα είδος αποδοτικού στοιχείου φίλτρου με υλικό φίλτρου βαθιού φίλτρου, που πληροί πλήρως τις κανονιστικές απαιτήσεις της βιοφαρμακευτικής ουσίας, κυρίως σχεδιασμένο και κατασκευασμένο ειδικά για την αφαίρεση μεγάλα στερεά περιεχόμενα όπως κύτταρα και θραύσματα κυττάρων και μπορούν να εφαρμοστούν σε υγρό κυτταροκαλλιέργειας θηλαστικών. Διαύγαση του προϊόντος λύσης βακτηρίων και κυττάρων ζυμομύκητα. Αφαίρεση πρωτεΐνης κυττάρου ξενιστή (HCP); Αφαιρέστε τον ιό και το DN. Αφαίρεση ενδοτοξινών; Αφαίρεση αντιαφριστικού.
Το προϊόν έχει τα πλεονεκτήματα του μικρού νεκρού όγκου, της γραμμικής ενίσχυσης, της δομής κάψουλας δίσκου, του σχεδιασμού συμπαγούς δομής και μπορεί να χρησιμοποιηθεί σε σειρά με άλλο εξοπλισμό, μικρό αποτύπωμα, σταθερό ρυθμό ροής, μεγάλη διάρκεια ζωής και χαμηλό κόστος.