Τεχνολογία μεμβράνης και διαύγαση εμβολίου (Ⅱ)

Στο προηγούμενο άρθρο, είχαμε κάποια προκαταρκτική εισαγωγή στα εμβόλια και τις στρατηγικές διευκρίνισης των εμβολίων, και θα συνεχίσουμε να τα εξερευνούμε στο υπόλοιπο αυτού του άρθρου. Σε συνέχεια των παραπάνω, θα συνεχίσουμε να μοιραζόμαστε διευκρινίσεις εμβολίων και σχετικές εφαρμογές μεμβρανικού ιστού.

 

2.2.2 Επίδραση των φυσικών και χημικών ιδιοτήτων του ιού

Αφού εξεταστεί το σύστημα παραγωγής και οι μέθοδοι για την απομάκρυνση των σχετικών μολυσματικών ουσιών στο στάδιο της αποσαφήνισης, είναι σημαντικό να ληφθούν υπόψη τα χαρακτηριστικά του ιού και να εστιάσουμε στη μεγιστοποίηση της απόδοσης του ιού.

 

2.2.2.1 Εύκολη απορρόφηση ιών
Τα θετικά φορτισμένα υλικά και τα βοηθητικά φίλτρα (όπως ο διατομίτης) έχουν αναπτυχθεί για τη βελτίωση των επιδράσεων βαθιάς διήθησης. Αν και το θετικό φορτίο αυξάνει τη δέσμευση νουκλεϊκών οξέων και HCP, ο διατόμιτος είναι γνωστό ότι δεσμεύει κυτταρικά υπολείμματα και κολλοειδή. Ωστόσο, αυτά τα υλικά μπορεί επίσης να συγκρατήσουν τον ιό μέσω του μηχανισμού προσρόφησης. Δεδομένου ότι ο ιός είναι συνήθως αρνητικά φορτισμένος στο διάλυμα, ενδέχεται να προκύψουν ηλεκτροστατικές αλληλεπιδράσεις με το θετικά φορτισμένο φίλτρο.
Οι ιοί μπορεί επίσης να συνδεθούν με τις υδρόφοβες ή μη ειδικές αλληλεπιδράσεις τους με ορισμένα υλικά φίλτρου (όπως ίνες διατομίτη ή γυάλινες ίνες). Οι ιοί με περίβλημα, λόγω του λιπιδικού τους περιβλήματος, είναι πιο ευαίσθητοι σε αυτή την προσρόφηση. Εάν ο ιός προσροφηθεί στο φίλτρο μέσω ηλεκτροστατικών αλληλεπιδράσεων και τα σωματίδια του ιού αποκολληθούν λόγω ανταγωνισμού αλατιού, το ξέπλυμα του φίλτρου με ένα ρυθμιστικό διάλυμα υψηλής αγωγιμότητας μπορεί να ανακτήσει μερικώς τον ιό. Ωστόσο, αυτό μπορεί επίσης να εκλούσει μολυντές όπως το HCP ή τα νουκλεϊκά οξέα. Επομένως, προτιμάται η χρήση ενός εναλλακτικού υλικού φίλτρου, όπως το πιο αδρανές πολυπροπυλένιο.
Adenovirus is easily adsorbed, but different results have been confirmed. Using positively charged diatomite and deep filters. Borosilicate glass fiber filter material is also very well recovered. On the other hand, a patent proposed by Weggeman involving clarification of 20 – 40% adenovirus losses at PER, et al. Cell cultures were prepared with similarly positively charged deep filters containing diatomite. In this case, the nominal polypropylene filter showed a very high viral recovery rate (> 90%).
Είναι ευρέως γνωστό ότι οι ιοί της γρίπης είναι επιρρεπείς σε απώλεια προσρόφησης κατά τη διαύγαση. Επομένως, η χρήση ενός φίλτρου χωρίς φόρτιση, του φίλτρου με βάση το πολυπροπυλένιο, είναι κατάλληλη για τη διαύγαση της συλλογής της γρίπης. Οι Thompson et al ανέφεραν τη χρήση ενός ονομαστικού ονομαστικού φίλτρου πολυπροπυλενίου 1,2 μm ακολουθούμενο από μεμβράνη PVDF 0,45 μm για την αποσαφήνιση του ιού της γρίπης που βασίζεται σε κύτταρα που παράγεται από κύτταρα MDCK. Πραγματοποιήθηκαν συνολικά εννέα δοκιμές καθαρισμού στην κλίμακα 20L, με φόρτωση 111 L / m2 για φίλτρο πολυπροπυλενίου 1,2 μm και 105 L / m2 για φίλτρο PVDF 0,45 μm. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι η πλειονότητα των εκτελούμενων ιών ανέκαμψε καλά (78-154%). Ανέφεραν επίσης έως και 58% αφαίρεση του hcDNA, αλλά όχι σημαντική αφαίρεση του HCP.

 

2.2.2.2 Αποκοπή ευαίσθητων ιών

Ορισμένοι ιοί (ενθυλακωμένοι ή μη) παρουσιάζουν χαμηλή μηχανική αντίσταση και μπορεί να καταστραφούν με έκθεση σε διάτμηση κατά τη διάρκεια της φυγοκέντρησης και των σταδίων φιλτραρίσματος με μεμβράνη. Οι δυνάμεις διάτμησης που δημιουργούνται κατά τη διάρκεια των σταδίων καθαρισμού που περιλαμβάνουν διήθηση ή χρωματογραφία μπορεί να προκαλέσουν πτώση του περιβλήματος του ιού, επηρεάζοντας έτσι τη μολυσματικότητα. Ανάλογα με το μέγεθος, το πάχος και τη γεωμετρία του καψιδίου, το ιικό καψίδιο μπορεί να είναι εύθραυστο ή, αντίθετα, ανθεκτικό σε υψηλές πιέσεις. Ορισμένοι ιοί με περίβλημα, όπως οι ιοί της γρίπης, είναι ελαστικοί στη μηχανική καταπόνηση και μπορούν να αντέξουν μεγάλες παραμορφώσεις. Από την άλλη πλευρά, η δύναμη διάτμησης μπορεί να προκαλέσει την πτώση του περιβλήματος των λιγότερο ανθεκτικών ιών, όπως οι ρετροϊοί, επηρεάζοντας έτσι τη μολυσματικότητα του ιού.

Τα εξωκυτταρικά παραγόμενα κελύφη VLP είναι επίσης πολύ ευάλωτα. Οι υψηλοί ρυθμοί διάτμησης παράγονται στη φυγόκεντρη διαδικασία, κυρίως στα μέρη εισόδου και εξόδου (υψηλοί ρυθμοί διάτμησης παράγονται στη διεπιφάνεια αερίου-υγρού). Όταν ο ιός καθαρίστηκε με φυγοκέντρηση βαθμίδωσης, η ικανότητα μεταγωγής ορισμένων ρετροϊών εξασθενούσε σημαντικά. Κατά το σχεδιασμό του φυγοκεντρικού διαχωρισμού, πρέπει να λαμβάνεται υπόψη η σχετική αστάθεια των ιικών σωματιδίων στις δυνάμεις διάτμησης. Η φυγόκεντρη δύναμη δεν είναι η μόνη πηγή διατμητικής κρούσης, πιο σημαντική είναι η σχεδίαση του εξοπλισμού, ειδικά κατά την εισαγωγή και την εξαγωγή έχουν επίσης σημαντική διατμητική κρούση. Οι διαφορές στο σχεδιασμό διαφορετικών κλίμακων μπορεί να οδηγήσουν σε διαφορές στην απόδοση και την ανάκτηση ιών ευαίσθητων στη διάτμηση σε διαφορετικές κλίμακες.

Οι ευαίσθητοι στη διάτμηση ιοί θα πρέπει να σχεδιάζονται προσεκτικά γιατί το μέγεθος της διατμητικής τάσης και ο χρόνος έκθεσης στην τάση (λόγω ανακυκλοφορίας) μπορεί να είναι υψηλοί. Για ιούς ευαίσθητους στη διάτμηση, προτιμώνται οι συσκευές ανοιχτού κυκλώματος (συσκευές κοίλης ίνας ή ανοιχτής πλάκας) για τη μείωση του στροβιλισμού και των δυνάμεων διάτμησης στο κανάλι τροφοδοσίας.

Η επιλογή των παραμέτρων λειτουργίας θα πρέπει επίσης να ελαχιστοποιεί τη ζημιά στα σωματίδια του ιού: χαμηλή διασταυρούμενη ροή, μέση διαμεμβρανική πίεση (TMP) και σύντομος χρόνος επεξεργασίας.

Η μόλυνση της μεμβράνης υπό υψηλή πίεση οδηγεί σε απώλεια της μολυσματικότητας του ιού, πιθανώς λόγω των δυνάμεων που μπορεί να ασκήσει η διατμητική δράση στο περίβλημα του ιού. Ο διαχωρισμός με βάση τη μεμβράνη βασίζεται στο μέγεθος και η συσσώρευση ιικών αναστολέων μεγάλου μοριακού βάρους και ιικών σωματιδίων μπορεί να μειώσει τη μολυσματικότητα των ιικών φορέων.

Η αποδόμηση των ευαίσθητων στη διάτμηση ιών κατά τη βαθιά διήθηση δεν είναι ευρέως τεκμηριωμένη. Η απώλεια ιών κατά τη βαθιά διήθηση αποδίδεται συχνότερα σε παγίδευση, προσρόφηση ή ιική υποβάθμιση του προϊόντος που εξαρτάται από το χρόνο και τη θερμοκρασία. Στην πραγματικότητα, παρόλο που μπορεί να προκύψει μηχανική καταπόνηση σε συστήματα NFF, ο χρόνος έκθεσης για τα προϊόντα NFF σε διάτμηση είναι πολύ μικρός σε σύγκριση με άλλες τεχνολογίες λόγω του γρήγορου μονό πέρασμα που παρουσιάζεται στα προϊόντα NFF.

 

2.2.2.3 Τομή σύμφωνα με το μέγεθος του διαφράγματος

Οι ιοί άνω του 100 nm μπορούν να διατηρηθούν αφαιρώντας μυκόπλασμα ή μεμβράνες στείρου βαθμού (0.22 μm και κάτω). Σε αυτή την περίπτωση, θα πρέπει να δοθεί ιδιαίτερη προσοχή στην επιλογή των φίλτρων. Για τα βήματα TFF μικροδιήθησης, προτιμώνται οι μεμβράνες 0.45μm ή 0.65μm για καλά κανάλια προϊόντων. Για διήθηση πολλαπλών βημάτων NFF, το πυκνότερο στρώμα είναι μεγαλύτερο ή ίσο με 0,45μm. Θα πρέπει να δίνεται προσοχή όταν επιλέγετε ένα βαθύ φίλτρο, καθώς ορισμένες συσκευές βαθέων φίλτρων μπορεί να περιέχουν ένα στρώμα μεμβράνης, το οποίο μπορεί να οδηγήσει σε απώλεια προϊόντος από τη μονάδα συγκράτησης. Η συσσώρευση ιών επηρεάζει αρνητικά την παραγωγή του ιού και ενισχύει την κατακράτηση του ιού λόγω του μεγέθους του ιού.

Σύμφωνα με ένα δίπλωμα ευρεσιτεχνίας των Andre και Champluvier, η ομογενοποίηση μπορεί να αποτρέψει ή να περιορίσει την απόφραξη του φίλτρου μειώνοντας το μέγεθος του αδρανούς, παρέχοντας υψηλότερη απόδοση. Η ομογενοποίηση βελτίωσε επίσης την ικανότητα φιλτραρίσματος της συγκομιδής, η οποία αυξήθηκε κατά 2.4-3 φορές.

Η υπερβολική ακαθαρσία μπορεί να επηρεάσει την ανάκτηση του ιού. Οι ακαθαρσίες τείνουν να φράζουν το φίλτρο και οι φραγμένοι πόροι της μεμβράνης μπορεί να έχουν ως αποτέλεσμα μειωμένους ρυθμούς διέλευσης του ιού. Σε δίπλωμα ευρεσιτεχνίας των de Vocht και Veenstra, αναφέρεται ότι η άμεση αποσαφήνιση της υψηλής κυτταρικής πυκνότητας Per. Η συλλογή με μεμβράνη TFF({0}}.65 ή 0.2 μm) οδήγησε σε ανάκτηση ιού χωρίς αδενοϊούς. Η ανάκτηση μπορεί να επιτευχθεί με επιλεκτική απομάκρυνση με κατακρήμνιση του DNA του κυττάρου ξενιστή πριν από το βήμα TFF των 0,65 μm. 70% των αδενοϊών.

 

 

2.3 Μελέτη περίπτωσης: Βελτιστοποίηση της διευκρίνισης του ιικού εμβολίου

Στο Διεθνές Συνέδριο για τις Βιολογικές Διεργασίες το 2011, η Sanofi Pasteur παρουσίασε μια ορθολογική προσέγγιση για τον έλεγχο των φίλτρων για την ανάπτυξη νέων διαυγασμένων αλληλουχιών για υποψήφια ιικά εμβόλια. Η έρευνα στοχεύει να ξεπεράσει τα προβλήματα που αντιμετωπίζονται στη βελτιστοποίηση των διαδικασιών καλλιέργειας κυττάρων και ιών. Οι τροποποιήσεις στη διαδικασία ανάντη οδήγησαν σε απώλεια απόδοσης 20% και πρόωρη μόλυνση του φίλτρου κατά τη διάρκεια του βήματος διαύγασης, με αποτέλεσμα να μην αυξηθεί η κλίμακα. Προκειμένου να δημιουργηθεί ένα εύρωστο και κλιμακωτό βήμα αποσαφήνισης, απαιτήθηκε πλήρης εκ νέου ανάπτυξη της αλληλουχίας φίλτρων, με ποσοστά ανάκτησης ιών υψηλότερα από 85%.

Based on internal experience and scientific publications, the team selected 27 filters for an initial screening study. Small scale virus adsorption tests were performed on various filter media (polypropylene, nylon, cellulose ester, glass fiber, charged adsorption filter) and structures (pleated or deep filter). The virus yield was measured by ELISA and the clarifying efficiency of the preselected filtrate was compared by checking the reduction of turbidity. Preliminary screening studies showed that nylon and charged filters retained viral particles and virus recovery. Ten percent. The virus recovery rate of polypropylene and polyether sulfone filter was >. 80%. Το ποσοστό ανάκτησης των φίλτρων εστέρα κυτταρίνης και ινών γυαλιού εξαρτάται από την αξιολόγηση του φίλτρου (20% ή 90%).

Ως δεύτερο βήμα, η Sanofi Pasteur αξιολόγησε αρκετούς συνδυασμούς (ακολουθίες φάσης 2 ή φάσης 3) των επτά φίλτρων που είχαν προεπιλεγεί στη μελέτη διαλογής. Η δοκιμή ταξινόμησης σταθερής ροής πραγματοποιήθηκε με ένα μικρό φίλτρο. Επιπλέον, αυτό το πείραμα χρησιμοποίησε υψηλότερη απόδοση από τη μελέτη διαλογής. Με βάση τα αποτελέσματα της ανάκτησης του ιού και της ικανότητας φίλτρου, η ομάδα επέλεξε τους δύο καλύτερους συνδυασμούς για περαιτέρω μελέτη.

- Ακολουθία 1 (Στάδιο 2): 30 μm ονομαστικό ονομαστικό διπλωμένο προφίλτρο πολυπροπυλενίου, ακολουθούμενο από σύνθετο φίλτρο πολλαπλών στρώσεων από εστέρα κυτταρίνης και ίνες γυαλιού (πόρωση 1/0,5 μm)

- Ακολουθία 2 (στάδιο 3): το ίδιο προφίλτρο (ονομαστικό ονομαστικό φίλτρο πολυπροπυλενίου 30 μm), ακολουθούμενο από ένα ενδιάμεσο πολυστρωματικό φίλτρο πολυπροπυλενίου και τέλος ένα ασύμμετρο φιλμ πολυαιθεροσουλφόνης.

 

The robustness of these two clarified sequences has been challenged by repeated constant flow sizing experiments with different harvest batches. While both potential sequences demonstrated enhanced capabilities compared to the reference sequence, only sequence 1 achieved virus recovery objectives (>85%), όπως φαίνεται στο Σχήμα 1.

Εικόνα 1 Μέση ανάκτηση ιών σε κάθε βήμα φιλτραρίσματος. Αξιολογήθηκαν μελέτες σταθερότητας για τρεις αλληλουχίες διήθησης, από τις οποίες μόνο η αλληλουχία 1 που χρησιμοποιεί ένα ονομαστικό ονομαστικό διπλωμένο πολυπροπυλένιο 30 μm και ένα φίλτρο εστέρα κυτταρίνης 1.0/0,5 μm και ίνες γυαλιού πέτυχε τον παγκόσμιο στόχο ανάκτησης .

Η φυγοκέντρηση αξιολογήθηκε επίσης ως το κύριο βήμα διαύγασης, ακολουθούμενη από τελική διήθηση {{0}},45 μm. Δοκιμάστηκαν αρκετά ζεύγη ταχύτητας/διάρκειας. Αν και ο ρυθμός διήθησης των 0,45 μm αυξήθηκε κατά δύο φορές, η τελική απόδοση ήταν χαμηλότερη από τον στόχο του 85%. Ως αποτέλεσμα, η φυγοκέντρηση δεν έχει μελετηθεί περαιτέρω.

Τέλος, η απόδοση των αλληλουχιών διήθησης ινών πολυπροπυλενίου και υάλου αξιολογήθηκε σε μεγαλύτερη κλίμακα (μέγεθος βιοαντιδραστήρα 160 L). Η σειρά φίλτρων φαίνεται στο σχήμα 2.

Εικόνα 2 Διευκρινίζει τον συνδυασμό φίλτρων και μια γραφική αναπαράσταση της απόδοσης βήματος της συμβολοσειράς. Η αμαξοστοιχία Α είναι η παραδοσιακή διαδικασία και η αμαξοστοιχία Β είναι η βελτιστοποιημένη διαδικασία. Η βελτιστοποιημένη ακολουθία Β μπορεί να μειώσει την περιοχή προ-διήθησης κατά 3 φορές, να ακυρώσει το ενδιάμεσο βήμα διήθησης και να μειώσει την τελική περιοχή διήθησης κατά 10 φορές, αυξάνοντας έτσι την παγκόσμια ανάκτηση του ιού κατά 3%.

Αρκετές παρτίδες αποσαφηνίστηκαν επιτυχώς χωρίς σημάδια απόφραξης του φίλτρου, χρόνος διεργασίας σύμφωνα με τα όρια παραγωγής και απόδοση ιού > ογδόντα πέντε τοις εκατό. Η βελτιστοποίηση του βήματος διευκρίνισης δεν είχε καμία επίδραση στα κατάντη βήματα και στα βασικά ποιοτικά χαρακτηριστικά του εμβολίου. Ως εκ τούτου, η επιλεγμένη αλληλουχία διαύγασης χρησιμοποιήθηκε στη διαδικασία παραγωγής εμβολίου (βιοαντιδραστήρας μεγέθους 1000 L) και η απόδοση επιβεβαιώθηκε με επιτυχία.

 

03 Διευκρίνιση των βακτηριακών εμβολίων

3.1 Σκέψεις για την αποσαφήνιση των βακτηριακών εμβολίων

Σύμφωνα με τον Ιατρικό Θησαυρό (2015), ένα βακτηριακό εμβόλιο ορίζεται ως ένα εναιώρημα αραιωμένων ή νεκρών βακτηρίων ή των αντιγονικών παραγώγων τους που χρησιμοποιείται για την πρόκληση ανοσοαπόκρισης για την πρόληψη ή τη θεραπεία βακτηριακών ασθενειών. Γενικότερα, τα βακτηριακά εμβόλια μπορούν να χωριστούν σε τέσσερις υποκατηγορίες με βάση τον τύπο του ενεργού αντιγόνου. Αυτός ο πράκτορας μπορεί να είναι:

- Σκοτώνει ή αποδυναμώνει ολόκληρα τα ζωντανά βακτήρια. Γνωστό και ως εμβόλιο BCG.

- Καθαρισμός αντιγονικών καθοριστικών παραγόντων (εμβόλια υπομονάδας). Εμβόλιο κατά του άνθρακα ή εμβόλιο ακυτταρικού κοκκύτη.

- Βακτηριακές τοξίνες (τοξοειδή). Τοξοειδή διφθερίτιδας και τετάνου.

- Πλασμίδιο (pDNA).

Λόγω της ευρείας ετερογένειας των προϊόντων της οικογένειας, οι προκλήσεις ανάντη και κατάντη διαδικασίας εξαρτώνται σε μεγάλο βαθμό από τον τύπο του εμβολίου που παράγεται. Επομένως, μετά το αρχικό στάδιο ζύμωσης μπορεί να καθαριστεί ή να μην καθαριστεί, έτσι ώστε να μπορεί να πραγματοποιηθεί το στάδιο της διαύγασης.

 

3.2 Στρατηγική αποσαφήνισης του βακτηριακού εμβολίου

3.2.1 Τοξοειδές

Τα δύο πιο κοινά τοξοειδή που παράγονται για χρήση εμβολίου είναι η διφθερίτιδα και ο τέτανος, τα οποία παράγονται από το Corynebacterium diphtheriae και το Clostridium tetani, αντίστοιχα. Η παραγωγή και των δύο εμβολίων υπόκειται σε αυστηρές κανονιστικές απαιτήσεις. Η τεχνική έκθεση του ΠΟΥ και τα παραρτήματά της κάνουν σαφείς συστάσεις για τη διασφάλιση της ποιότητας, της ασφάλειας και της αποτελεσματικότητας των εμβολίων κατά του τετάνου και της διφθερίτιδας. Για την παραγωγή και των δύο εμβολίων ισχύουν οι γενικές καλές πρακτικές παρασκευής και οι εργαζόμενοι πρέπει να είναι κατάλληλα εκπαιδευμένοι και να λαμβάνουν ενισχυτική ανοσοποίηση κατά των δύο ασθενειών.

Η GMP απαιτεί αυστηρά να αποδεικνύεται η καθαρότητα και η ποιότητα του τελικού προϊόντος. Σύμφωνα με τον ΠΟΥ και το EP, η αποτελεσματικότητα ενός τελικού εμβολίου κατά του τετάνου πρέπει να προσδιορίζεται με σύγκριση in vivo ή με οποιαδήποτε άλλη αποδεδειγμένη μέθοδο με κατάλληλη ουσία αναφοράς βαθμονομημένη σε διεθνείς μονάδες σύμφωνα με το Διεθνές Πρότυπο για τοξοειδές του τετάνου. Οι ενημερωμένες απαιτήσεις για την αποτελεσματικότητα δημοσιεύθηκαν το 2011 και ενδέχεται να διαφέρουν ανάλογα με τη μέθοδο αξιολόγησης. Πρέπει επίσης να αποδεικνύεται η ασφάλεια (χωρίς τοξίνες και επανορθωτική τοξικότητα) κάθε παρτίδας εμβολίου. Τέλος, πρέπει να αντιμετωπιστεί η σταθερότητα των εμβολίων, ειδικά σε πραγματικό χρόνο.

 

3.2.2 Εμβόλιο πλασμιδικού DNA

Τα εμβόλια πλασμιδικού DNA χρησιμοποιούνται για σκοπούς υγείας των ζώων και αρκετά εμβόλια πλασμιδικού DNA για ανθρώπινη χρήση βρίσκονται σε διάφορα στάδια ανάπτυξης και κλινικής αξιολόγησης. Μετά τη ζύμωση του E. coli, τα βακτήρια συλλέγονται και διασπώνται για να απελευθερωθεί πλασμιδικό DNA.

Η απομάκρυνση των κυτταρικών υπολειμμάτων συνήθως επιτυγχάνεται με φυγοκέντρηση ή διήθηση. Το θέμα έχει καλυφθεί εκτενώς σε πρόσφατες δημοσιεύσεις. Σε αυτή τη δημοσίευση, οι τρέχουσες διεργασίες και προκλήσεις του pDNA προς τα πάνω, προς τα κάτω και τη σύνθεση.

Οι συγγραφείς παρέχουν επίσης πληροφορίες για τα κενά σε κάθε βήμα της τυπικής διαδικασίας κατασκευής pDNA και πιθανές μελλοντικές καινοτομίες ή/και τρέχοντα τεχνολογικά κενά που θα μπορούσαν να οδηγήσουν σε περαιτέρω βελτιστοποίηση της διαδικασίας.

Τα εμβόλια πλασμιδικού DNA παρασκευάζονται σε δύο στάδια. Πρώτον, τα βακτηριακά κύτταρα απομακρύνονται από το μέσο καλλιέργειας και δεύτερον, τα κυτταρικά υπολείμματα μετά την απομάκρυνση της κυτταρικής λύσης. Ανάλογα με την κλίμακα, τα κύτταρα συλλέγονται χρησιμοποιώντας φυγοκέντρηση ή μικροδιήθηση TFF. Η φυγόκεντρος δίσκων-σωρού εκτοξεύεται κατά διαστήματα με υψηλή ταχύτητα και η απόδοση των υπερτυλιγμένων πλασμιδίων είναι χαμηλή λόγω βλάβης διάτμησης κατά την εκφόρτιση. Εάν πρέπει να χρησιμοποιηθεί φυγοκέντρηση, η καλύτερη είναι μια συμπαγής φυγόκεντρος. Συσκευές ανοιχτού καναλιού, επίπεδες TFF με μεμβράνες μικροδιήθησης 0.1 ή 0.2 μm ή συσκευές κοίλων ινών μπορούν να λειτουργήσουν καλά.

Επειδή οι συσκευές κοίλων ινών έχουν υψηλή χωρητικότητα στερεού φορτίου, μερικές φορές δίνεται προτεραιότητα. Συνήθως αυτές οι διεργασίες λειτουργούν σε 3-5 φορές τη συγκέντρωση, ακολουθούμενες από 3-5 όγκους διήθησης. Προκειμένου να μειωθεί η διάτμηση και ο καλύτερος έλεγχος της πόλωσης της μεμβράνης, συνιστώνται ιδιαίτερα οι λειτουργίες ελέγχου διείσδυσης. Αν και οι φυγόκεντρες είναι πιο αποδοτικές από άποψη κόστους σε μεγάλης κλίμακας εμπορικές λειτουργίες, οι διαδικασίες μικρότερης κλίμακας τείνουν να χρησιμοποιούν φιλτράρισμα λόγω της φορητότητας και της ευκολίας λειτουργίας.

Τα κροκιδωτικά έχουν χρησιμοποιηθεί για τη διευκόλυνση της επεξεργασίας, αλλά μπορεί να οδηγήσει σε απώλεια προϊόντος. Μερικοί συνιστούν επίσης τη χρήση σωματιδίων αδρανούς γης διατόμων, ακολουθούμενη από διήθηση με σακούλες.

Cell lysis produces viscous products, including large particles, cell fragments, soluble impurities, fine colloidal particles, and pDNA. Due to the complexity of the material, removing such fine solids is a difficult separation. Gradient density deep filter or open hole structure (>0.45m) τα φίλτρα μεμβράνης είναι καλά στην αφαίρεση κυτταρικών υπολειμμάτων. Λόγω της ισχυρής απόφραξης των κυτταρικών υπολειμμάτων, προτιμάται η χαμηλή ροή ή η χαμηλή πίεση διήθηση. Για αυτό το βήμα έχουν χρησιμοποιηθεί μικροφίλτρα που βασίζονται σε Tff και σακούλες βιομηχανικής κλίμακας. Η στατική (σε δοχείο ανάμιξης) και η συνεχής (χρησιμοποιώντας στατικό αναμικτήρα σε σειρά) ρωγμές απαιτεί διαφορετικά φίλτρα.

 

3.3 Μελέτη περίπτωσης: Σύγκριση της αποτελεσματικότητας των μεθόδων φυγοκέντρησης, NFF και TFF για τη διαύγαση των τοξινών του τετάνου

Οι Muniandi et al. συνέκρινε τρεις διαφορετικές μεθόδους για τη διαύγαση των τοξινών και των τοξινών του τετάνου από τα υγρά ζύμωσης, δηλαδή τη φυγοκέντρηση, τη βαθιά διήθηση (NFF) και το TFF. Το υλικό δοκιμής παρήχθη σε ζυμωτήρα 4{5}}0L χρησιμοποιώντας ένα τροποποιημένο μέσο Miller (MMM). Στη μελέτη φυγοκέντρησης, τα κύτταρα διαχωρίστηκαν από την καρδιά στις 4000 RPM σε δοχείο 6 × 1 L για 60 λεπτά. Ελήφθησαν δείγματα υπερκειμένου για την ανίχνευση ανάκτησης τοξοειδούς. Η βαθιά διήθηση χρησιμοποιεί φίλτρα βάθους 0,45μm και 0,22μm που περιέχουν γη διατόμων και κυτταρίνη για να καθαρίσει τον ζωμό ζύμωσης. Η διαδικασία πραγματοποιείται σε θερμοκρασία 35 βαθμών και 12psi.

Μια μονάδα TFF ανοιχτού επίπεδου πάνελ είναι θερμικά συνδεδεμένη με μια μεμβράνη PVDF 0,22μm στη μέθοδο TFF. Η διαδικασία διαύγασης που βασίζεται σε TFF πραγματοποιήθηκε με ρυθμό εγκάρσιας ροής 2000 L/h στους 23 βαθμούς και το διαυγασμένο διήθημα συμπυκνώθηκε σε ταχύτητα διαυγούς ροής 1000 L/h στους 25 βαθμούς χρησιμοποιώντας μια συμβατική μεμβράνη PES σάντουιτς TFF 30 kD. Το διαυγασμένο υγρό κρέατος (περίπου 6L) συμπυκνώνεται 10 φορές σε αυτή τη διαδικασία υπερδιήθησης. Πραγματοποιήθηκαν δοκιμές τοξοειδούς τετάνου σε συμπυκνωμένα δείγματα συγκράτησης για την αξιολόγηση της ανάκτησης του προϊόντος.

Το βαθύ φιλτράρισμα είχε ως αποτέλεσμα ποσοστό ανάκτησης προϊόντος περίπου 89%, με τις μονάδες TFF να έχουν ως αποτέλεσμα ποσοστό ανάκτησης προϊόντος άνω του 97%. Οι διαδικασίες μικροδιήθησης και υπερδιήθησης αποδίδουν σταθερά υψηλότερες ανακτήσεις προϊόντων από τη διαδικασία NFF. Αυτά τα αποτελέσματα βασίζονται σε δοκιμές κροκίδωσης (Lf).

 

04Διαύγαση πολυσακχαριτικών εμβολίων

4.1 Εξέταση της διευκρίνισης του εμβολίου πολυσακχαρίτη

Η διαδικασία παραγωγής τόσο των μη συζευγμένων/ελεύθερων πολυσακχαριδικών εμβολίων όσο και των εμβολίων συζευγμένου πολυσακχαρίτη ξεκινά με την καλλιέργεια των βακτηρίων του ξενιστή σε έναν ζυμωτήρα. Στο τέλος της ζύμωσης, τα βακτήρια μπορούν να υποβληθούν σε επεξεργασία με καθαριστικά όπως DOC (δεοξυχολικό νάτριο), Triton®X-100 ή άλλα κατάλληλα αντιδραστήρια για την καταστροφή των βακτηρίων και την προώθηση της απελευθέρωσης πολυσακχαριτών. Λόγω της μεγάλης χωρητικότητας της μπαταρίας, η απευθείας συλλογή μέσω NFF δεν είναι οικονομικά εφικτή καθώς η απόδοση μπορεί να είναι πολύ χαμηλή. Ως εκ τούτου, η ιδανική επιλογή είναι η χρήση φυγόκεντρου για τον διαχωρισμό των συστάδων κυττάρων. Μπορεί επίσης να χρησιμοποιηθεί η σειρά μικροδιήθησης TFF. Το κέντρο/διεισδυτικό χωρίς κύτταρα που περιέχει τον πολυσακχαρίτη που μας ενδιαφέρει διαυγάζεται περαιτέρω με ένα σύστημα βαθιάς διήθησης NFF, που ακολουθείται από διήθηση με βιολογικό πολτοποιημένο και στη συνέχεια προχωρά σε επεξεργασία προς τα κάτω για περαιτέρω καθαρισμό.

 

4.2 Στρατηγική αποσαφήνισης εμβολίου πολυσακχαριτών

4.2.1 Πρώτη Διαδικασία Διευκρίνισης

Η φυγοκέντρηση είναι μια από τις πιο κοινές τεχνικές για τον διαχωρισμό των κυττάρων από τα υγρά ζύμωσης. Ανάλογα με την κλίμακα, μπορεί να επιλεγεί συνεχής φυγοκέντρηση ή φυγοκέντρηση παρτίδας. Είναι σημαντικό να σημειωθεί ότι η σωστή βελτιστοποίηση των συνθηκών φυγοκέντρησης και η λειτουργία τους είναι απαραίτητη για την επιτυχή κατάντη καθαρισμό. Κατά την επιλογή μιας συγκεκριμένης μεμβράνης TFF και μεγέθους πόρων, είναι σημαντικό να έχετε κατά νου το μοριακό βάρος των πολυσακχαριτών, οι οποίοι είναι συχνά μεγάλοι και δομικά πολύπλοκοι, με μοριακά βάρη που κυμαίνονται από περίπου 500kDa σε περισσότερο από 1000kDa. Λόγω του μεγάλου μεγέθους ανοικτών πόρων, η χρήση μεμβρανών MF 0,22μm, 0,45μm, 0,65μm μπορεί να εξασφαλίσει την επιτυχή ανάκτηση των μορίων PS στο οσμωτικό διάλυμα.

 

4.2.2 Δευτερεύουσα Διαδικασία Διευκρίνισης

Η διαύγεια/θολότητα του διαλύματος ζύμωσης χωρίς κύτταρα που φτάνει στο δευτερεύον στάδιο διαύγασης εξαρτάται από τα συγκεκριμένα βακτήρια, τον τύπο διάσπασης, τον μεμονωμένο τύπο ορού και την τεχνική που χρησιμοποιείται για το πρωταρχικό στάδιο διαύγασης. Η θολότητα του κέντρου μπορεί να κυμαίνεται από περίπου 50 έως 150 NTU. Ένα θετικά φορτισμένο βαθύ φίλτρο κλασματικής πυκνότητας κατασκευασμένο από εμποτισμένο διατόμο με γεμισμένες ίνες κυτταρίνης μπορεί να χρησιμοποιηθεί για τη διαύγαση και τη μείωση της θολότητάς του σε < 5NTU.

Η παροχή όγκου αυτού του βαθέως φίλτρου μπορεί να κυμαίνεται από περίπου 150 L/m3 έως 250 L/m3. Συνήθως, το διαυγασμένο διάλυμα προϊόντος φιλτράρεται μέσω μιας επακόλουθης 0,45 μm βιουποστηριζόμενης ποιότητας αναγωγής ή 0,22 μm αποστειρωμένης μεμβράνης ποιότητας για την απομάκρυνση τυχόν υπολειπόμενων σωματιδίων κυττάρων, κολλοειδών και πιθανών μικροοργανισμών.

 

4.3 Μελέτη περίπτωσης: Διευκρίνιση του κέντρου ζωμού ζύμωσης Streptococcus pneumoniae μετά από φυγοκέντρηση

Τα κύτταρα διαχωρίστηκαν με την προσθήκη ζωμού ζύμωσης {{0}.1% (ο/ο) τύπου 8 Streptococcus pneumoniae (20 L) με συνεχή φυγοκέντρηση. Το κέντρο της συλλογής φιλτράρεται μέσα από δύο ξεχωριστά θετικά φορτισμένα και βαθιά φίλτρα από γη διατόμων που περιέχουν ίνες κυτταρίνης. Το μεμονωμένο διήθημα βαθέως φίλτρου στη συνέχεια διηθήθηκε μέσω μεμβράνης PVDF βαθμού αναγωγής βιολογικής φόρτισης 0,45μm. Όλες οι δοκιμές διήθησης πραγματοποιήθηκαν σε λειτουργία σταθερής ροής με περισταλτικές αντλίες. Οι δοκιμές διήθησης χρησιμοποιώντας φορτισμένο βαθύ φίλτρο και ζωμό ζύμωσης ορότυπου 8 του Streptococcus pneumoniae οδήγησαν σε πτώση της θολότητας από περίπου 120 NTU σε 3 NTU. Οι δοκιμές πραγματοποιήθηκαν με ρυθμό ροής 140.150 L/m2/hr και διαφορά πίεσης τελικού σημείου 20-25 psi, με παροχή όγκου περίπου 180-200 L/m2.

Παρόμοιες δοκιμές διήθησης πραγματοποιήθηκαν στον ζωμό ζύμωσης του ορότυπου Streptococcus pneumoniae 19Α. Το φυγοκεντρημένο υγρό 19Α διαυγάζεται μέσω ενός φορτισμένου βαθύ φίλτρου, το οποίο μειώνει τη θολότητα από περίπου 40 NTU σε 3 NTU. Οι δοκιμές πραγματοποιήθηκαν με σταθερό ρυθμό ροής περίπου 140-160 L/m2/hr και επιτεύχθηκε ογκομετρική παροχή 200-230L/m2 σε πίεση τελικού σημείου περίπου 15 psid. Η ανάλυση HLPC των δειγμάτων προϊόντος που συλλέχθηκαν κατά τη διάρκεια των δοκιμών αξιολόγησης διήθησης δεν έδειξε σημαντική απώλεια απόδοσης για βαθιά διήθηση ή για μεμβράνες 0,45 μm (ή 0,22 μm).

 

05 Σύναψη

Η ανάπτυξη των διαδικασιών διαύγασης απαιτεί την ενσωμάτωση πολλών διεργασιών μονάδας όπως η φυγοκέντρηση, το TFF-MF, η βαθιά διήθηση και η άσηπτη διήθηση. Η βελτιστοποίηση της διαδικασίας αποσαφήνισης απαιτεί την κατανόηση του τρόπου με τον οποίο οι διαφορετικές λειτουργίες της μονάδας επηρεάζουν η μία την άλλη. Η πρόκληση είναι η επιλογή τεχνολογιών και εργαλείων (εξοπλισμός και εξαρτήματα) για την κάλυψη των ολοένα και πιο περίπλοκων απαιτήσεων των ρευστών διεργασίας που παράγονται από τους σημερινούς πιο αποτελεσματικούς βιοαντιδραστήρες. Η αύξηση της παραγωγικότητας ανάντη (τίτλος ιών, πυκνότητα κυττάρων κ.λπ.), κυτταρικά υπολείμματα και προϊόντα κυτταρικής λύσης αυξάνει τη δυσκολία της διαδικασίας διαύγασης και συγχέει την επιλογή του εξοπλισμού διαχωρισμού και διήθησης.

Ο σχεδιασμός του εξοπλισμού, η ευκολία χρήσης και η καθαριότητα θα πρέπει να λαμβάνονται υπόψη κατά την επιλογή κλίμακας διαδικασίας. Αυτό θα εξασφαλίσει αποτελεσματική μετατροπή και ασφάλεια χειριστή όταν αντιμετωπίζετε απορριπτόμενα φίλτρα. Προκειμένου να αναπτυχθεί η διαδικασία αποσαφήνισης, είναι σημαντική η ισχυρή ενσωμάτωση των βημάτων αποσαφήνισης για να διασφαλιστεί ότι η επεξεργασία της ανάντη συγκομιδής είναι οικονομικά αποδοτική. Μια σειρά από μονάδες φιλτραρίσματος είναι άμεσα διαθέσιμες για τη διευκόλυνση των εργαστηριακών δοκιμών, της πιλοτικής παραγωγής και της επεξεργασίας πλήρους μεγέθους. Εφαρμόζοντας ένα καλά σχεδιασμένο σχέδιο εργασίας κλιμάκωσης που αξιολογεί πολλαπλές επιλογές διευκρίνισης, μπορεί κανείς να επιλέξει και να διαστασιολογήσει με σιγουριά τα φίλτρα διευκρίνισης για να προστατεύσει τις λειτουργίες της μονάδας κατάντη με ταυτόχρονη μείωση του λειτουργικού κόστους.

Η αποσαφήνιση του εμβολίου παρουσιάζει πολλές προκλήσεις. Τυπικά, η διαδικασία διήθησης πρέπει να προσαρμόζεται στο σύστημα παραγωγής, στον παράγοντα αδρανοποίησης ή λύσης και στην παρουσίαση αντιγόνου, όχι απαραίτητα στα εμβόλια. Οι παραδοσιακές διεργασίες εμβολίων χρησιμοποιούν συνήθως φυγοκέντρηση για να διαυγάσουν αρχικά το εμβόλιο. Τα σύγχρονα εμβόλια με πολλαπλές τεχνολογικές πλατφόρμες και μικρότερους όγκους επεξεργασίας καθιστούν τα εμβόλια πιο κατάλληλα για διαύγαση με τεχνολογίες που βασίζονται σε μεμβράνες. Τα πρόσφατα αναπτυγμένα εμβόλια που χρησιμοποιούν σύγχρονες κυτταρικές σειρές και συστήματα έκφρασης και χρησιμοποιώντας πιο καθορισμένες συνθήκες κυτταροκαλλιέργειας καθιστούν πολλές διαδικασίες εμβολίων πιο ευνοϊκές για τη διήθηση.

 

Ωστόσο, η ετερογένεια στο αντιγονικό συστατικό ή στο «αντιγόνο στόχο» των προϊόντων εμβολίου αυξάνει την πολυπλοκότητα της διαύγασης της διήθησης. Τα αντιγόνα ποικίλλουν ως προς το μέγεθος, τη χημεία της επιφάνειας και το φορτίο. Αυτά τα χαρακτηριστικά επηρεάζουν την απόδοση και την ανάκτηση των αντιγόνων. Τα εμβόλια παρουσιάζουν μοναδικές προκλήσεις για αποσαφήνιση, κυρίως λόγω του μεγέθους των μακρομορίων τους. Αυτό, σε συνδυασμό με ζητήματα ικανοτήτων γύρω από την αποσαφήνιση, αυξάνει την ανάγκη για καθοδήγηση σχετικά με τις στρατηγικές ανάπτυξης διαδικασιών.

Το μέγεθος και η κλίμακα μιας επιχείρησης εμπορικής κλίμακας για την παραγωγή εμβολίων έχει σημαντικό αντίκτυπο στην επιλογή της τεχνολογίας διαύγασης. Καθώς βρίσκεται ανάντη της διαδικασίας, η σωστή βελτιστοποίηση αποσαφήνισης είναι κρίσιμης σημασίας για την επιτυχία των κατάντη λειτουργιών της μονάδας, μεγιστοποιώντας την απόδοση, την ανάκτηση και την ευρωστία της διαδικασίας. Ενώ η φυγοκέντρηση παραμένει μια βιώσιμη τεχνική επιλογή για την πρωτογενή διαύγαση, οι μονάδες μικροδιήθησης ανοιχτού καναλιού (TFF) για την πρωτογενή διαύγαση και τα λεπτά βαθιά φίλτρα ή τα φίλτρα μεμβράνης για δευτερογενή διαύγαση κερδίζουν αποδοχή στη βιομηχανία εμβολίων. Αυτή η αλλαγή οφείλεται στην ανάγκη για ταχύτερη επεξεργασία, ταχεία ανάπτυξη διεργασιών, φορητές διαδικασίες και υλοποιήσεις μιας χρήσης. Το NFF προσφέρει μια οικονομική διαδικασία κατάλληλη για μικρές έως μεγάλης κλίμακας επιλογές μιας χρήσης. Λόγω των μεταβαλλόμενων ρυθμιστικών αναγκών, η διαθεσιμότητα προασηπτικών συσκευών ή μονάδων ακτινοβολίας γάμμα που έχουν σχεδιαστεί για αυτόκαυστο προάγει την ταχύτερη προσαρμογή των τεχνολογιών που βασίζονται σε NFF ή TFF.

Πολλές κλασικές διαδικασίες εμβολίων περιλαμβάνουν την εξέλιξη των λειτουργιών της μονάδας αποσαφήνισης, σε μεγάλο βαθμό λόγω των κανονιστικών περιορισμών και του σχετικού υψηλού κόστους της επανεπικύρωσης και της εκ νέου υποβολής ή των κλινικών δοκιμών. Η διαδικασία πλατφόρμας που χρησιμοποιεί το σχήμα διαύγασης που βασίζεται στη διήθηση έχει χρησιμοποιηθεί ευρέως σε αρκετούς βιολογικούς παράγοντες με υψηλό βαθμό επιτυχίας. Τα παραδείγματα και οι περιπτώσεις που περιγράφονται σε αυτό το έγγραφο δείχνουν ότι οι κατασκευαστές εμβολίων έχουν τη δυνατότητα να επιτύχουν αυτό το επίπεδο σταθερότητας, οικονομικής βιωσιμότητας και χρησιμότητας μιας χρήσης ακολουθώντας την προσέγγιση του προτύπου.

Άλλα πλεονεκτήματα της διήθησης έναντι της φυγοκέντρησης είναι ιοί ευαίσθητοι στη διάτμηση ή ιοί που τείνουν να συσσωρεύονται στη διεπαφή αέρα. Καθώς οι κατασκευαστές συσκευών φέρνουν νέα προϊόντα στην αγορά, οι κατασκευαστές εμβολίων θα συνεχίσουν να είναι καλύτερα εξοπλισμένοι για τη διαδικασία αποσαφήνισης.

 

Ως η πρώτη εταιρεία στο κύκλωμα εντοπισμού, η Guidling Technology έχει συσσωρεύσει επαρκή σχετική εμπειρία στη διαύγαση εμβολίων. Η Guidling Technology είναι μια εταιρεία ανάπτυξης και παραγωγής που εστιάζει στη βιοφαρμακευτική και κυτταρική καλλιέργεια, τον καθαρισμό και τον διαχωρισμό. Τα προϊόντα χρησιμοποιούνται ευρέως στη βιοϊατρική, τη διάγνωση, τη βιομηχανική διήθηση υγρών, τη διαδικασία ανίχνευσης, διαύγασης, καθαρισμού και συγκέντρωσης. Η Guidling ανέπτυξε με επιτυχία σωλήνα φυγόκεντρου υπερδιήθησης, κασέτα μεμβράνης υπερδιήθησης/μικροδιήθησης, φίλτρο αφαίρεσης ιού, συσκευή φίλτρου εφαπτομενικής ροής, στοίβα βαθιάς μεμβράνης κ.λπ., που ανταποκρίνονται πλήρως στα σενάρια εφαρμογής της βιοφαρμακευτικής και κυτταρικής καλλιέργειας.

Οι μεμβράνες και τα φίλτρα μεμβράνης μας χρησιμοποιούνται ευρέως στη συμπύκνωση, την εκχύλιση και τον διαχωρισμό της προδιήθησης, της μικροδιήθησης, της υπερδιήθησης και της νανοδιήθησης. Η μεγάλη γκάμα σειρών προϊόντων μας, από μικρές εργαστηριακές διηθήσεις μίας χρήσης έως συστήματα φιλτραρίσματος τύπου παραγωγής, δοκιμές στειρότητας, ζύμωση, κυτταροκαλλιέργεια και άλλα, μπορεί να καλύψει τις ανάγκες δοκιμών και παραγωγής.