Εφαρμογή Υπερδιήθησης στη Φυσική Εκχύλιση Κολλαγόνου

Το κολλαγόνο, ως φυσικός πόρος πρωτεΐνης, έχει καλή βιοσυμβατότητα, χαμηλή αντιγονικότητα, βιοαποδομησιμότητα και αιμόσταση, τη σφιχτή ελικοειδή δομή του και τα δικά του χαρακτηριστικά, που όλα παρέχουν προϋποθέσεις για την εκβιομηχάνισή του. Το κολλαγόνο και τα παραπροϊόντα του δεν χρησιμοποιούνται μόνο ως υλικά συσκευασίας, καλλυντικά και προϊόντα υγειονομικής περίθαλψης, αλλά και ως πρόσθετα τροφίμων για τη βελτίωση του προϊόντος κρέατος και διαδραματίζει σημαντικό ρόλο, ειδικά στον ιατρικό τομέα.

 

Τι είναι το κολλαγόνο?

 

Το κολλαγόνο είναι ένα βιολογικό μακρομόριο, το κύριο συστατικό του ζωικού συνδετικού ιστού και η πιο άφθονη και ευρέως κατανεμημένη λειτουργική πρωτεΐνη στα θηλαστικά, που αντιπροσωπεύει το 25% έως 30% της συνολικής πρωτεΐνης και ακόμη και έως και 80% ή περισσότερο σε ορισμένους οργανισμούς. Παίζει το ρόλο του δεσμευτικού ιστού στα ζωικά κύτταρα.

Μετράται ότι το σώμα ενός ενήλικα έχει περίπου 3 κιλά κολλαγόνο, το οποίο υπάρχει κυρίως στο ανθρώπινο δέρμα, στα οστά, στα μάτια, στα δόντια, στους τένοντες, στα εσωτερικά όργανα (συμπεριλαμβανομένης της καρδιάς, του στομάχου, των εντέρων, των αιμοφόρων αγγείων) και σε άλλα μέρη του ανθρώπινου σώματος. Η λειτουργία του είναι η διατήρηση της μορφολογίας και της δομής του δέρματος, των ιστών και των οργάνων, και είναι επίσης μια σημαντική πρώτη ύλη για την επισκευή διαφόρων ιστών μετά από τραυματισμό.

 

Υπάρχουν πολλοί τύποι πρωτεΐνης κολλαγόνου και οι συνηθισμένοι τύποι είναι τύπου Ι, τύπου II, τύπου III, τύπου V και XI. Λόγω της καλής βιοσυμβατότητας, βιοδιασπασιμότητας και βιοδραστικότητας του, το κολλαγόνο έχει χρησιμοποιηθεί ευρέως στα τρόφιμα, την ιατρική, τη μηχανική ιστών, τα καλλυντικά και άλλους τομείς.

Πώς να εξαγάγετε φυσικό κολλαγόνο

Οι ζωικοί ιστοί από ζώα και πουλερικά είναι ο κύριος τρόπος για να αποκτήσουν οι άνθρωποι φυσικό κολλαγόνο και τα πεπτίδια κολλαγόνου του. Ωστόσο, λόγω των σχετικών ασθενειών των ζώων και ορισμένων θρησκευτικών πεποιθήσεων, η χρήση του κολλαγόνου και των προϊόντων του από χερσαία θηλαστικά από τους ανθρώπους είναι περιορισμένη και η ανάπτυξη στρέφεται σταδιακά στους θαλάσσιους οργανισμούς. Η Ευρωπαϊκή Αρχή για την Ασφάλεια των Τροφίμων (EFSA) επιβεβαίωσε ότι ακόμη και το κολλαγόνο που προέρχεται από οστά ζώων δεν έχει τη δυνατότητα να μολύνει τη νόσο των τρελών αγελάδων και άλλες συναφείς ασθένειες. Λόγω των διαφορών στη σύνθεση αμινοξέων και στον βαθμό διασύνδεσης, τα υδρόβια ζώα, ειδικά το κολλαγόνο πλούσιο στα απόβλητα επεξεργασίας τους όπως το δέρμα, τα οστά και τα λέπια, έχουν πολλά πλεονεκτήματα που δεν έχει το κολλαγόνο των ζώων. Επιπλέον, το κολλαγόνο που προέρχεται από θαλάσσια ζώα είναι προφανώς ανώτερο από το κολλαγόνο από ζώα της ξηράς σε ορισμένες απόψεις, όπως η χαμηλή αντιγονικότητα και η υποαλλεργικότητα. Επομένως, το υδρόβιο κολλαγόνο μπορεί σταδιακά να αντικαταστήσει το κολλαγόνο των χερσαίων ζώων. Ως παράδειγμα λήφθηκε η διαδικασία εξαγωγής κολλαγόνου από λέπια ψαριού κυπρίνου.

 

Εξαγωγή κολλαγόνου από λέπια ψαριού κυπρίνου με μέθοδο υπερδιήθησης

1. Υλικά και μέθοδοι

1.1 Δείγμα δοκιμής

Ακατέργαστο υδατικό εκχύλισμα κολλαγόνου.

1.2 Μέθοδοι δοκιμής

1.2.1 Οδός διαδικασίας υπερδιήθησης

 

1.2.2 Προσδιορισμός διεργασίας προδιήθησης

Σε αυτή τη δοκιμή, η μέθοδος διήθησης υπό κενό και η μέθοδος μικροδιήθησης συγκρίνονται και αναλύονται για να προσδιοριστεί η καλύτερη διαδικασία διήθησης πριν από τη διήθηση. Οι ειδικές μέθοδοι δοκιμής είναι οι εξής:

① Το ακατέργαστο εκχύλισμα νερού κολλαγόνου διηθήθηκε με άντληση κενού διηθητικού χαρτιού για να αφαιρεθούν τα αιωρούμενα σωματίδια και οι ακαθαρσίες στο εκχύλισμα νερού.

② Το ακατέργαστο εκχύλισμα νερού κολλαγόνου διηθήθηκε με μεμβράνη μικροδιήθησης 0,2μm για την απομάκρυνση της αδιάλυτης ύλης και των ακαθαρσιών στο εκχύλισμα νερού.

 

1.2.3 Επιλογή μεγέθους πόρων μεμβράνης υπερδιήθησης

Το μέγεθος πόρων της μεμβράνης υπερδιήθησης ήταν 100 kDa.

 

1.2.4 Πείραμα απλού παράγοντα της διαδικασίας καθαρισμού με υπερδιήθηση

Η τεχνολογία υπερδιήθησης χρησιμοποιήθηκε για τον καθαρισμό του ακατέργαστου εκχυλίσματος νερού κολλαγόνου και μελετήθηκαν πειράματα μονού παράγοντα σχετικά με τις επιδράσεις της πίεσης λειτουργίας, της θερμοκρασίας λειτουργίας και της τιμής του pH στην κατακράτηση κολλαγόνου. Αφού ο εξοπλισμός υπερδιήθησης ξεκίνησε για ένα χρονικό διάστημα και σταθεροποιήθηκε, μελετήθηκε η επίδραση διαφόρων παραγόντων στην κατακράτηση κολλαγόνου.

 

1.2.5 Τύπος Υπολογισμού

 

2. Αποτελέσματα και ανάλυση

2.1 Αποτελέσματα ανάλυσης της διαδικασίας προδιήθησης

Τα αποτελέσματα σύγκρισης των δύο μεθόδων διήθησης της εκχύλισης υπό κενό και της μικροδιήθησης φαίνονται στον ακόλουθο πίνακα.

 

Από τον πίνακα φαίνεται ότι τόσο η μέθοδος διήθησης κενού όσο και η μέθοδος μικροδιήθησης μπορούν να αφαιρέσουν ακαθαρσίες και αδιάλυτα στερεά στο διάλυμα, αλλά η μέθοδος μικροδιήθησης έχει καλύτερη προστατευτική επίδραση στις πρωτεΐνες, δηλαδή η απώλεια δεν είναι εμφανής και η μέθοδος διήθησης κενού είναι εύκολο να προκαλέσει απώλεια πρωτεϊνών. Επιπλέον, η μέθοδος διήθησης υπό κενό εμφανίζεται θολότητα μετά την τοποθέτηση του διηθήματος για μια χρονική περίοδο και το μικροδιήθημα είναι ακόμα διαυγές και διαφανές, επομένως η μικροδιήθηση επιλέγεται ως η διαδικασία προεπεξεργασίας της υπερδιήθησης.

 

2.2 Δοκιμή απλού παράγοντα της διαδικασίας υπερδιήθησης

2.2.1 Επίδραση της πίεσης υπερδιήθησης στον ρυθμό κατακράτησης

Υπό τις συνθήκες θερμοκρασίας 40 βαθμών και pH=9.0, η επίδραση των διαφορετικών πιέσεων υπερδιήθησης (0.07MPa, {{9} }.09MPa, 0,11MPa, 0,13MPa και 0,15MPa) μελετήθηκε για την κατακράτηση πρωτεΐνης. Τα αποτελέσματα φαίνονται στο παρακάτω σχήμα.

Όπως φαίνεται από το παραπάνω σχήμα, με την αύξηση της πίεσης λειτουργίας, ο ρυθμός κατακράτησης πρωτεΐνης σταδιακά μειώνεται. Όταν η πίεση λειτουργίας είναι {{0}}.07MPa, ο ρυθμός κατακράτησης πρωτεΐνης είναι 96,53%, και όταν η πίεση λειτουργίας είναι 0,15 MPa, ο ρυθμός κατακράτησης πρωτεΐνης είναι 84,38%. Αυτό οφείλεται στο ότι η επίδραση διαχωρισμού της υπερδιήθησης σε ουσίες πραγματοποιείται από τη διαφορά πίεσης. Στην περιοχή της χαμηλής πίεσης λειτουργίας, μικρά μόρια μπορούν να περάσουν γρήγορα μέσα από τη μεμβράνη, ενώ μεγάλα μόρια μπορούν να παγιδευτούν από τη μεμβράνη υπερδιήθησης και να συσσωρευτούν στην επιφάνεια της μεμβράνης. Αυτή τη στιγμή, η επιφάνεια της μεμβράνης και το εκχύλισμα νερού σχηματίζουν μια διαφορά συγκέντρωσης, με αποτέλεσμα την αντίσταση πόλωσης της συγκέντρωσης. Αυτή τη στιγμή, η πίεση είναι σχετικά χαμηλή και δεν μπορεί να έχει μεγάλη επίδραση στο ποσοστό συγκράτησης. Ωστόσο, με την αύξηση της πίεσης, η αντίσταση πόλωσης της συγκέντρωσης αυξάνεται σταδιακά και η διαφορά συγκέντρωσης μεταξύ της επιφάνειας της μεμβράνης και του εκχυλίσματος νερού φτάνει σε ισορροπία. Όταν η πίεση υπερβεί αυτή την ισορροπία, μπορεί να σχηματιστεί ένα στρώμα γέλης στην επιφάνεια της μεμβράνης (που είναι σύμφωνο με τη θεωρία ότι το στρώμα πόλωσης και συμπύκνωσης της συγκέντρωσης σχηματίζονται κατά τη διάρκεια της υπερδιήθησης) και η πίεση συνεχίζει να αυξάνεται, το πάχος του στρώματος γέλης αυξάνεται και η πρωτεΐνη που παραμένει στην επιφάνεια της μεμβράνης αυξάνεται επίσης. Αυτό έχει ως αποτέλεσμα χαμηλότερο ποσοστό συγκράτησης. Για να εξασφαλιστεί το αποτέλεσμα διαχωρισμού της μεμβράνης, η βέλτιστη παράμετρος πίεσης λειτουργίας είναι 0,07 MPa.

 

2.2.2 Επίδραση της θερμοκρασίας στην κατακράτηση πρωτεΐνης

Υπό τις συνθήκες πίεσης {{0}}.11MPa και pH=9.0, οι επιδράσεις διαφορετικών θερμοκρασιών, συγκεκριμένα 25 βαθμών , 30 βαθμών , 35 βαθμών , 40 μοιρών και 45 βαθμών , στην πρωτεΐνη η κατακράτηση μελετήθηκε. Τα αποτελέσματα φαίνονται στο παρακάτω σχήμα.

Όπως φαίνεται από το παραπάνω σχήμα, ο ρυθμός συγκράτησης της μεμβράνης υπερδιήθησης αυξάνεται σταδιακά με την αύξηση της θερμοκρασίας και φτάνει στο μέγιστο στους 45 βαθμούς, με ρυθμό συγκράτησης 97,01%. Αυτό συμβαίνει επειδή το ιξώδες του κολλαγόνου σχετίζεται στενά με τη θερμοκρασία. Όταν η θερμοκρασία είναι χαμηλή, το ιξώδες του κολλαγόνου είναι μεγαλύτερο και η συσσώρευση κολλαγόνου στην επιφάνεια της μεμβράνης σχηματίζεται εύκολα αντίσταση, με αποτέλεσμα χαμηλό ποσοστό κατακράτησης. Όταν η θερμοκρασία αυξάνεται, το ιξώδες του κολλαγόνου μειώνεται, η αλληλεπίδραση μεταξύ των μορίων κολλαγόνου εξασθενεί και ο ρυθμός μεταφοράς μάζας αυξάνεται, το φαινόμενο της πόλωσης της συγκέντρωσης εξασθενεί και ο ρυθμός κατακράτησης αυξάνεται. Ένας άλλος λόγος για την αύξηση του ρυθμού κατακράτησης είναι ότι αυξάνεται η θερμοκρασία, αυξάνεται αντίστοιχα η διαλυτότητα του κολλαγόνου και μειώνεται το φαινόμενο του κολλαγόνου να φράζει τη μεμβράνη, οπότε η βέλτιστη θερμοκρασία υπερδιήθησης είναι 45 βαθμούς.

 

2.2.3 Επίδραση της τιμής του pH στην κατακράτηση πρωτεΐνης

Υπό τις συνθήκες πίεσης {{0}}.11MPa και θερμοκρασίας 40 βαθμών, η επίδραση διαφορετικών συνθηκών pH, δηλαδή pH=6.0, pH{{{{ 5}}.{{10}}, pH=8.0, pH=9.0 και pH=10.0, μελετήθηκε ο ρυθμός κατακράτησης. Τα αποτελέσματα φαίνονται στο παρακάτω σχήμα.

 

As can be seen from the figure above, in the range of pH 6-7, the protein retention rate decreases with the increase of pH value, and the minimum value is 82.13% when pH=7.0; when pH>7, the retention rate gradually increases with the increase of pH value. This is because the isoelectric point of collagen is pH=7. At the isoelectric point, the protein is in a state of precipitation, which is easy to stay on the surface of the membrane and block the membrane, thus reducing the retention rate. When pH>7, ο ρυθμός κατακράτησης αυξάνεται σταδιακά με την αύξηση της τιμής του pH. Αυτό συμβαίνει επειδή η μεμβράνη υπερδιήθησης είναι μεμβράνη σφενδάμου πολυαιθέρα με αρνητικό φορτίο και το κολλαγόνο είναι αρνητικά φορτισμένο υπό αλκαλικές συνθήκες. Τα αρνητικά φορτισμένα μόρια κολλαγόνου σχηματίζουν μια αμοιβαία αποκλειστική κατάσταση με τη μεμβράνη υπερδιήθησης με το ίδιο φορτίο, επομένως τα μόρια κολλαγόνου δεν είναι εύκολο να παραμείνουν στην επιφάνεια της μεμβράνης και να μπλοκάρουν τη μεμβράνη. Επομένως, η βέλτιστη τιμή pH της υπερδιήθησης είναι 8-10.

 

2.3 Βελτιστοποίηση διαδικασίας υπερδιήθησης και επαλήθευση αποτελεσμάτων

Σύμφωνα με την ανάλυση του Design-Expert8.05 λογισμικού, οι βέλτιστες παράμετροι διεργασίας είναι: πίεση λειτουργίας 0.14MPa, θερμοκρασία λειτουργίας 40.98 μοίρες, pH διαλύματος{{7 }}.43, και το ποσοστό διατήρησης είναι 92,551%. Λαμβάνοντας υπόψη τη λειτουργικότητα των πραγματικών παραμέτρων, οι συνθήκες υπερδιήθησης επιλέχθηκαν ως πίεση λειτουργίας 0,14 MPa, θερμοκρασία λειτουργίας 40 μοίρες και τιμή pH 9,50 του διαλύματος υλικού και η επαλήθευση δοκιμής ξεκίνησε μετά την έναρξη και σταθεροποίηση του συστήματος υπερδιήθησης. Το αποτέλεσμα του ποσοστού κατακράτησης ήταν (92,61±0,1) % (n=3). Οι προβλεπόμενες τιμές της εξίσωσης είναι βασικά παρόμοιες με τις μετρούμενες τιμές, γεγονός που δείχνει ότι τα αποτελέσματα των παραμέτρων της προβλεπόμενης συνθήκης συμφωνούν με τα αποτελέσματα των πραγματικών συνθηκών.

 

2.4 Αποτελέσματα ηλεκτροφορητικής ανάλυσης

Το καθαρισμένο κολλαγόνο αναλύθηκε με ηλεκτροφόρηση SDS-PAGE και τα αποτελέσματα φαίνονται στο ακόλουθο σχήμα.

 

Όπως φαίνεται από το παραπάνω σχήμα, η λωρίδα 1 είναι το καθαρισμένο κολλαγόνο αυτής της δοκιμής και η λωρίδα 2 είναι το τυπικό δείγμα κολλαγόνου του τένοντα της γάμπας. Μπορεί να φανεί από την ηλεκτροφόρηση SDS-PAGE ότι το κολλαγόνο σε αυτή τη μελέτη μπορεί να αναγνωριστεί ως κολλαγόνο, αλλά τα όρια μεταξύ της πεπτιδικής αλυσίδας a1 και της πεπτιδικής αλυσίδας a2 δεν φαίνεται να είναι σαφή. Μπορεί να φανεί από τον ηλεκτροφορητικό χάρτη ότι δεν υπάρχει άλλη ακαθαρσία πρωτεΐνης, επομένως μπορεί να συναχθεί το συμπέρασμα ότι το καθαρισμένο κολλαγόνο είναι υψηλής καθαρότητας.

Σχετικά με το Guidling

 

Η Guidling Technology είναι μια εθνική επιχείρηση υψηλής τεχνολογίας που εστιάζει στα βιοφαρμακευτικά προϊόντα, την κυτταροκαλλιέργεια, τον καθαρισμό και τη συγκέντρωση βιοϊατρικής, τη διάγνωση και τα βιομηχανικά υγρά. Έχουμε αναπτύξει με επιτυχία συσκευές φυγόκεντρου φίλτρου, κασέτες υπερδιήθησης & μικροδιήθησης, φίλτρο ιών, σύστημα TFF, φίλτρο βάθους, κοίλες ίνες κ.λπ. Τα οποία ανταποκρίνονται πλήρως στα σενάρια εφαρμογής βιοφαρμακευτικών προϊόντων, κυτταροκαλλιέργειας κ.λπ. Οι μεμβράνες και τα φίλτρα μεμβράνης μας χρησιμοποιούνται ευρέως στη συμπύκνωση, την εκχύλιση και τον διαχωρισμό της προδιήθησης, της μικροδιήθησης, της υπερδιήθησης και της νανοδιήθησης. Οι πολλές σειρές προϊόντων μας, από μικρού μεγέθους εργαστηριακό φιλτράρισμα μιας χρήσης έως συστήματα φιλτραρίσματος παραγωγής, δοκιμές στειρότητας, ζύμωση, κυτταροκαλλιέργεια και άλλα, καλύπτουν τις ανάγκες δοκιμών και παραγωγής. Η Guidling Technology ανυπομονεί να συνεργαστεί μαζί σας!